Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

この方法は、移植と臓器保存の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の用途には、新規の灌流剤や灌流添加剤の試験、臓器評価用に設計された試験ソフトウェア、臓器修復のための実験の実施などがあります。この技術の主な利点は、ここで紹介する常温性ex vivo肝臓灌流モデルがシンプルで、簡単に複製可能で、低コストで、幅広いアプリケーションがあることです。

まずは16ゲージのポータルカフの準備からスタートします。チューブの 5 mm セクションをカットし、2.5 mm を測定してセクションの中点を決定します。中点を切開し、チューブの前半分を取り外します。

止血剤を使用して、このフラットになった部分を粉砕します。ライターを使用して血管カテーテルのもう一方の端を溶かし、唇を作成します。次に、27ゲージの血管カテーテルから注入口を切断し、カテーテルだけを残して胆管カニューレを準備します。

これを10ゲージのカニューレチューブの27センチメートルセクションに接続します。麻酔をかけたラットを、鼻を麻酔鼻円錐に置き、四肢を固定します。モニターを左後肢に取り付けて、バイタルサインを監視します。

つま先をつまんで、適切な麻酔の深さを確認します。動物の腹部に70%イソプロピルアルコールをスプレーし、乾かします。動物に滅菌ドレープを置きます。

その後、鋭利なハサミを使って剣状突起から恥骨まで正中線切開を行った後、腹膜にそっと入り、筋肉を切開します。切開部を左右に横方向に伸ばして、肝臓の下縁のレベルで十字を形成します。この時点で、イソフルラン麻酔を2%に下げ、湾曲した蚊クランプを使用して剣状突起を引っ込め、肋骨開創器を使用して肋骨を引っ込めます。

次に、鋭利なハサミを使用して、鎌状、静脈、および胃肝靭帯を切断します。横隔静脈の位置を特定し、7-0縫合糸でできるだけ起点に近づけて結束させ、漏れを防ぎます。次に、滅菌した湿らせた綿の先端アプリケーターを使用して、ラットを内臓を抜出します。

0.9%生理食塩水で湿らせたガーゼで腸を包み、血管系を伸ばさないように注意してください。次に、下大静脈を解剖して余分な組織を取り除きます。分岐部よりもちょうど優れたIVCの後ろを解剖し、後で使用するために4-Oシルク縫合糸のループを通過させます。

次に、右腎臓を引っ込めて右副腎静脈に露出させ、右肝臓の葉をガーゼで上方向に引っ込めます。IVCのできるだけ近くで7-0シルク縫合糸で右副腎静脈を結び、タイの遠位でそれを横切って焼灼します。次に、脾臓静脈を慎重に解剖します。

オフの場合は2つの7-0シルク縫合糸を使用して結び、2つの縫合糸の間に切り込みます。胃十二指腸動脈の周囲を解剖した後、7-0シルク縫合糸と結紮で胃十二指腸動脈を結びます。次に、肝動脈の周りを解剖し、その周りに7-0シルク縫合タイをゆるく置きます。

次に、胆管を解剖します。次に、胆管の長さを確認し、遠位端で結び、胆管の周りに縫合糸のループをできるだけ近位に配置します。小さなハサミを使用して、ダクトの直径の半分の穴を切り、27ゲージのカテーテルを胆管の近位に留置します。

ローマンサンダルタイ縫合糸を使用してカテーテルを所定の位置に結びます。次に、27ゲージの針を使用して、0.5ミリリットルのヘパリンを陰茎静脈(IVC)に注入します。次に、前に配置した4-0シルク縫合糸を使用してIVCをクランプして結び、前に配置した7-0シルク縫合糸を使用して肝動脈を結びます。

次に、マイクロサージェリークリップを使用して門脈をクランプします。22ゲージの血管カテーテルを使用して門脈をカニューレし、肝臓が白くなるまで100単位のヘパリンを含む60ミリリットルの冷たい0.9%生理食塩水で洗い流します。肝臓を洗い流した後、肝上IVCを露出させ、胸のできるだけ高いところに切り込みます。.

横隔膜の周りを切断し、次に肝動脈、IVC、門脈、および追加の靭帯を切断することにより、肝切除術を実施します。肝臓を持ち上げ、氷のように冷たい0.9%の生理食塩水を置きます。最後に、16ゲージの血管カフを門脈に留置し、肝臓をex vivoの正常体温肝灌流回路に接続します。

各灌流を開始する前に、回路の目視検査を実施して、回路コンポーネントまたはチューブの損傷または蓄積を特定する必要があります。回路上にバクテリアやその他の物質が蓄積している場合は、部品を交換または清掃する必要があります。灌流液を毎分2ミリリットルで流すことから始めます。

門脈圧の急上昇がないかモニターに注意してください、これは血管が閉塞し、カニューレの再配置が必要であることを示している可能性があります。7-0シルク縫合糸を使用して、灌流液と縫合糸の戻り流のために、先端静脈カニューレをカフ付き門脈に挿入します。両方のカニューレが所定の位置に配置されたら、水の10〜16センチメートルの範囲の生理学的圧力に達するまで、灌流液の流れを1分あたり1ミリリットル上げ始めます。

灌流中にプレポートとポストポートから1ミリリットルのサンプルを取り出します。各1ミリリットルのサンプルを2つの0.5ミリリットルのサンプルに分割します。0.5ミリリットルのアリコートの1つを極低温チューブ内の液体窒素でスナップ凍結し、残りの0.5ミリリットルの灌流液を使用して動脈血ガス分析を実行します。

次に、pHを測定し、必要に応じて灌流液を緩衝してpH 7.4に戻します。4時間の灌流後、肝臓を灌流回路から切断します。肝臓を0.5グラムのセグメントに分割し、極低温チューブに移し、液体窒素でスナップフリーズします。

ALTは、ゼロ、30、60、90、120、150、180、210、および240分の灌流で測定されました。ベース灌流液とPEG-CATグループのALTは、150分、180分、210分、240分で黒で示されているベース灌流液と比較して、大幅に少なくなります。組織ATPは、塩基灌流液とPEG-CATの併用群で、塩基灌流液単独群と比較して維持されました。

組織MDAの産生は、塩基性灌流液群の方が、塩基性灌流液とPEG-CATの併用群よりも有意に高かった。総GSHは、ベース灌流液とPEG-CATを併用した群で、ベース灌流液単独群と比較して維持されました。提案された常温ex vivo肝臓灌流の各アプリケーションは、廃棄されたヒト臓器で試験する前に、次にヒト肝臓で試験する前に、動物モデルで系統的に試験する必要があります。

ここで紹介するモデルは、簡単に複製でき、無関係なテストが不要で、低コストであるため、理想的です。このビデオを見れば、ラットを使用して安価で簡単に複製可能な正常体温ex vivo肝臓灌流モデルを実行する方法について十分に理解できるはずです。