文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

この方法は、ゼブラフィッシュコミュニティに、in vivoでは達成できない解像度で細胞間ダイナミクスを解析するためのツールを提供します。また、ゼブラフィッシュ細胞株の不足を補うこともできます。この手法の主な利点は、元の組織から直接初代細胞を単離してトランスフェクションするため、細胞株を保持する必要がないことです。

プロトコルを開始するには、受精の2日後、またはdpfでゼブラフィッシュの胚を準備します。初日には、選択したゼブラフィッシュ株のいくつかの交配を設定しました。2日目は魚と交尾し、産卵後すぐに10センチのプラスチック製のシャーレに卵を集めます。

プラスチック製のパスツールピペットで死んだ卵や汚染された卵を取り除きます。卵をダニオー30%で1回洗います0.0001体積あたりの重量メチレンブルー。次に、培地をメチレンブルーを含まない新鮮なダニオー30%と交換し、卵を摂氏28度で一晩インキュベートします。

3日目に死んだ胚と汚染された胚を取り除き、培地をDanieau 30%に交換します次に、胚を摂氏28度で一晩インキュベートします。4日目に、皿に約10ミリリットルが残るまで培地を取り出して絨毛膜を取り除きます。プロナーゼ1ミリリットルにつき1ミリグラムを添加し、シェイカーで胚を室温で約30分間インキュベートし、すべての絨毛膜が剥離するまでインキュベー

次に、皿底面の穴の周りにシリコングリースを敷き詰め、グリースを接着剤としてカバースリップを貼り付けます。グリースが皿の底とカバースリップの間の隙間を塞いでいることを確認してください。ガラス底の皿は、冷たい水道水と石鹸でしっかりと、しかし慎重に洗ってください。

ガラス底の皿を脱イオン水で3回すすぎ、石鹸を取り除きます。次に、皿の蓋と皿の底を風乾し、さらに使用するまで清潔な箱に保管します。培養準備の日には、皿の蓋と皿の底の両方の内側を70%エタノールで湿らせます。

皿の蓋と皿の底を内側を上にして、層流とUV光のある滅菌作業台に置きます。エタノールが蒸発するまで皿を風乾させ、UVライトを20分間加えます。この処理の後、皿を組み立てて無菌にします。

各ガラス底皿の中央に0.1ミリグラム/ミリリットルのポリL-リジンの皿を200マイクロリットルピペットでコーティングし、ピペットチップで表面張力を壊すことによりカバースリップに液体を広げます。その後、室温でベンチの下で60分間皿をインキュベートします。インキュベーション後、滅菌済みの1倍リン酸緩衝生理食塩水またはPBSで一度洗浄し、液体を取り除きます。

さらに使用するまで、皿はベンチの下に保管してください。培養準備の4日目に、胚を新鮮なプラスチック製パスツールピペットを備えた無菌細胞培養皿に移します。すべての胚が直径約2センチメートル以下の大きな滴に集まるまで、液体を段階的に取り除きます。

胚を入れた皿を滅菌作業台に置き、皿が半分満たされるまで二酸化炭素に依存しない培地を追加します。卵黄ピペットを取り外すには、200マイクロリットルのピペットチップを使用して胚を上下させます。成功したデヨールクは、媒体の曇りによって認識できます。

次に、細胞培養皿に70%エタノールを入れ、別の細胞培養皿に新鮮な細胞培養培地を入れます。切り取られた1000マイクロリットルのピペットチップを使用して、ハンドル付きの滅菌40ミクロンセルストレーナーに胚を移します。ストレーナーのハンドルを取り、エタノールを入れた皿に浸して、すべての胚が5秒間沈むようにします。

エタノール処理後、すぐにストレーナーを胚と一緒に新鮮な細胞培養培地で皿に浸します。次に、胚を滅菌済みの1.5ミリリットルの反応チューブに移します。コラゲナーゼ2型を胚に加えます。

垂直チューブローテーターでチューブをインキュベートします。1000マイクロリットルのピペットチップで混合物を上下にピペッティングすることにより、残りの細胞塊を解離します。次に、通気スロットを備えた滅菌細胞ストレーナーを介して細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管にろ過します。

ストレーナーを10ミリリットルの新鮮な細胞培養液ですすいでください。細胞を180倍gで3分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットの形成を注意深くチェックします。

その後、上清を除去し、最初に使用した胚30個あたり200マイクロリットルの新鮮な細胞培養培地に細胞を再懸濁します。次に、調製したポリ-L-リジンコーティングガラス底皿のガラス領域に直接細胞懸濁液200マイクロリットルをピペットで移し、細胞を60分間付着させます。6ミリリットルの新鮮細胞培養培地を加え、初代細胞を摂氏28度でインキュベートします。

次に、倒立顕微鏡を使用して摂氏28度で目的のイメージングアプリケーションを実行します。計数チャンバー内のセル番号を決定します。次に、1.5ミリリットルの反応チューブで、10マイクログラムの超高純度プラスミドDNAを50万個の細胞と混合し、必要に応じて滅菌PBSで総容量を100マイクロリットルに調整します。

エレクトロポレーションの前に溶液を20秒間完全に再懸濁します。次に、細胞DNAミックスを直ちにエレクトロポレーションキュベットに移し、キュベットをエレクトロポレーションデバイスに入れ、サンプルをエレクトロポレーションします。エレクトロポレーションの直後に、細胞DNA混合物を300マイクロリットルの新鮮な細胞培養培地を含む1.5ミリリットルの反応チューブに移します。

最後に、前のセクションで行ったように、細胞懸濁液の200マイクロリットルをプレートします。このビデオの方法を用いて、小胞体を標的とする赤色蛍光タンパク質やミトコンドリアを標的とする黄色蛍光タンパク質などの蛍光オルガネラマーカーをコードするpCS2ポジティブベースのプラスミドのトランスフェクションを非常に詳細に可視化しました。融合タンパク質MitoTag-YFPと、赤色蛍光タンパク質tdTomatoに融合した微小管マーカーヒトダブルコルチン、およびシアン蛍光タンパク質に融合した核マーカーHistone H2Bを同時トランスフェクションして、同時解析を行いました。

蛍光タンパク質mCitrineに融合した膜マーカー小胞関連膜タンパク質1に陽性の小胞の動きの時間経過から選択された画像は、高い時間的および空間的解像度を提供します。時間の経過に伴う形態学的変化は、明るい蛍光タンパク質の発現によって細胞全体を標識することにより、容易に観察できます。それらのエレクトロポレーションプロトコルは、組み合わせ遺伝学にも適しています。

解離技術と基本的な培養条件は、野生型ゼブラフィッシュの成体脳組織にも適用され、最初に破片でコーティングされた培養物が複雑なニューロン様ネットワークに徐々に発達することを示しています。ヒト疾患のゼブラフィッシュモデルや組織特異的なレポーター系統が多数利用可能であるため、私たちの手法は、特定の細胞タイプや発生段階に焦点を当てて生合成を強調する細胞内メカニズムを記述するために使用することができます。