キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

この方法は、ショウジョウバエの脳代謝に関する重要な疑問や、グリア細胞の過剰増殖が代謝のリプログラミングにどのように影響するか、食事や行動が代謝を変えるかどうかについて、重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ハエの脳を1つの無傷の組織全体として代謝的に分析でき、一度に1つの脳を測定するだけで再現性のある結果が得られることです。この方法は、ハエの脳の代謝に関する洞察を提供するだけでなく、想像円板やC.elegansなどの他の組織やモデルシステムにもそれぞれ適用できます。

微小組織拘束具を調製するには、保存容器から、測定対象の脳ごとに1つの微小組織拘束具を選択し、さらに拘束のみのコントロールとして使用するために少なくとも3つを選択します。メッシュバスケットと6ウェルプレートを使用して、拘束具を70%のエタノールですすぎ、脱イオン水で3回、毎回2分間洗浄します。拘束具がまだアルコール臭を放つ場合は、追加の水洗を実行してください。

微小組織拘束具をアッセイ培地で洗浄し、使用する準備ができるまで溶液中に置いておきます。Drosophila melanogasterの幼虫の脳を解剖するには、培養したOrgan Rのバエのバイアルから後期3番目の幼虫を選択します。幼虫を500マイクロリットルの1x PBSを含む清潔な解剖スポットプレートのウェルに入れます。

次に、幼虫をウェルで静かに振って洗い、別のきれいなウェルに移します。次に、スポットプレートを解剖顕微鏡の下に置きます。幼虫の中央部を1組のピンセットでつかみ、2組目のピンセットでアイフックをつかみます。

2セットのピンセットを使用して、幼虫を反対方向に優しく滑らかに引っ張ります。通常、アイフックに取り付けられたままで、通常はアイアンテナディスクが取り付けられている脳を視覚化します。アイフックを使用して脳を所定の位置に保持し、追加の組織を慎重に取り除きます。

最後に、アイフックを脳から分離します。次に、ピンセットを使用して、解剖した脳を1x PBSを含む新しいウェルに移します。解剖した脳を96ウェル代謝アッセイプレートに加えるには、まず、実験用ウェル、コントロールウェル、拘束専用ウェル、バックグラウンドウェルを含むすべてのウェルに50マイクロリットルのアッセイ培地を追加します。

次に、各ウェルに1つの脳を慎重に配置します。解剖顕微鏡下で、曲がった針のマイクロプローブを使用して、脳をウェルの底に押し付けます。プローブを使用して、3つの隆起した球の中央に脳をそっと配置します。

96ウェル代謝アッセイプレートに微小組織拘束装置を追加するには、まずそれを端に置きます。顕微鏡で、プラスチックリングを下向きにし、メッシュを上にして向きを変えます。次に、プレートを顕微鏡から取り外します。

ピンセットを使用して両側の拘束具をつかみ、そっと井戸に落とします。曲がった針のマイクロプローブを使用して、拘束具をウェルに押し込みます。この手法が意味のある結果をもたらすためには、微小組織拘束具を各ウェルの中心脳上に適切に配置する必要があります。

顕微鏡下で、解剖された脳が組織拘束具を通して見えること、およびそれがウェルの中心にあることを確認し、アッセイで使用されるすべてのウェルに対して手順を繰り返します。130 マイクロリットルのアッセイ培地を、実験用ウェル、コントロールウェル、および拘束専用ウェルのそれぞれに慎重に添加します。メディアの追加中に、ブレインとマイクロ組織の拘束具が動かないことを確認します。

次に、180 マイクロリットルのアッセイ培地を 4 つのコーナーウェルに加えて、バックグラウンドコントロールとして使用します。この手順では、ユーティリティプレートを取り外し、蓋のないセルプレートを代謝分析装置と同じ向きで追加します。Load Cell Plate」を選択すると、装置がセルプレートを取り込み、トレイを閉じてからアッセイを開始します。

アッセイが完了したら、排出された細胞プレートとカートリッジを取り外してください。解剖顕微鏡を使用して、アッセイが完了した後も脳と微小組織の拘束体がウェル内に適切に配置されていることを確認し、異常のあるウェルを分析から除外します。最適化された条件に従うと、幼虫と成体の脳を用いたアッセイでは、安定した6番目の時点、つまりアッセイの約25分後には、OCRの読み取り値が150ピコモル/分をわずかに超える結果になります。

このレートは、少なくとも 30 分から最大 2 時間維持されます。ECARは、6番目の時点で成体の脳の方が幼虫の脳よりもわずかに低く、少なくとも30分間維持されます。この知見は、成長を支えるために幼虫期の解糖系の増加に対応する。

オリゴマイシンなどのミトコンドリア阻害剤を注射すると、OCRの読み取り値が下がってATP依存性呼吸が明らかになり、ロテノンとアンチマイシンAによるさらなる治療によりOCRが低下し、ミトコンドリア以外の酸素消費量が明らかになります。この手順を試行する際は、アッセイを実行する前と分析中に、脳を中央に配置し、微小組織の拘束が所定の位置に固定されていることを確認することを忘れないでください。この手順に続いて、定量的PCRやウェスタンブロット分析などの他の方法を実行して、遺伝子発現が観察された代謝表現型にどのように寄与するかについての追加の質問に答えることができます。