Name: PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学ぶ、マウス肺腺がん細胞の同所性同種移植モデル。免疫能を持つマウスで腫瘍形成を研究し、遺伝子編集による遺伝的要因の影響を解析する効率的な手法です。

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著者は、ティッシュ セクションの準備で彼女の助けのサフィア Zahma を感謝したいです。

下を通りのすべて実験的プロトコルは倫理的なガイドラインに従ってくださいし、オーストリア連邦省の科学、研究および経済によって承認されました。
注:ここでのプロトコルは、同系の受信者にマウス肺腺癌細胞の同所性同種移植モデルをについて説明します。セルは KrasLSL G12Dの腫瘍肺から分離することが: p53フロリダ州/フロリダ(KP) マウス7,18, 利用可能な場合、社内と同じ背景とセックスのマウスに移植しました。セルは、他の研究グループから提供された、正確なバック グラウンドは不明のまま、最大許容値を保証する移植の C57BL/6 と 129S マウス間のクロスの F1 世代の使用お勧めします。
1. セル準備
<ol><li>種子 KP 細胞 10% ウシ胎仔血清 (FCS)、グルタミン、100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン (以下、標準培養液) を添加した RPMI で約 50% の confluency に移植する前に 24 時間の。37 ° C、5% CO2約 95% の細胞培養を孵化させなさい相対湿度。</li>
	<li>次の日に 10 cm プレートあたり 5 分の 1 mL のトリプシン-EDTA (0.05% リン酸緩衝生理食塩水 [PBS]) を使用してセルを収穫し、その後、9 ml の標準培養液中の剥離細胞を再懸濁します。</li>
	<li>診断でセルをカウントし、50 mL コニカル遠心管中の実験に必要なセルの数を転送します。 注: 2.5 105 x と 1 x 106 KP あたりマウス細胞を移植をお勧めしますが、これは研究者のニーズに基づいた適応かもしれない。</li>
	<li>その後、300 x gで 5 分間細胞を遠心、上清を吸引し、ピペットを使用して、血清および抗生物質無料 RPMI で (吸入マウスあたり 1 x 106 KP 細胞) の 2 × 107/mL の密度で細胞を再懸濁します、0.01 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を添加しました。</li>
	<li>移植まで氷の上細胞を保ちます。</li>
</ol>2. 同所性同種移植気管内配送で
<ol><li>ケタミン (100 mg/kg 体重) とキシラジン (10 mg/kg 体重) の混合物の皮下注入によるマウス (8-12 週齢) を落ち着いた。</li>
	<li>麻酔で設定し、挿管カテーテルを準備します。したがって、単にはさみで端を切断することによってカテーテルの針を鈍らせます。その後、針の端に完全にカテーテルをプッシュします。</li>
	<li>ペダル反射を介してしっかりつま先が締めつけることにより適切な麻酔レベルを確認し、眼軟膏を目に適用します。</li>
	<li>縫合糸で、上顎中切歯をフックして挿管プラットフォーム (図 1 a) でマウスを修正し、胸が縫合下に垂直であることを確認します。</li>
	<li>胸 (図 1 b) を照らすにフロントの足の間に光ファイバー ケーブルを配置します。</li>
	<li>慎重にマウスの口を開くし、消毒フラット鉗子を使用して舌を抜きます。喉頭喉頭蓋と披裂軟骨 (図 1) を視覚化して白色光の放出を探します。</li>
	<li>気管の開口部がはっきりと見えると、カチッとカテーテルに気管 (図 1)。挿入するカテーテルの長さは、それは肺内腺癌細胞、肺の均一な分布を保証する分岐下行ってはならないので年齢や、動物のサイズによって異なります。すぐにカテーテルから針を抜きます。</li>
	<li>気管内カテーテルの適切な配置は、白色光輝いているカテーテル (図 1E) によって示されます。気管内カテーテルの位置を確認するために、カテーテルに水を含む 1 mL 注射器を接続します。注射器で水は、呼吸 (図 1 f) に従って上下に急速に移動します。 注:経験豊富な研究者によっては、この手順を省略できます。</li>
	<li>チューブを手で保持することによって細胞懸濁液を温めるし、その後、カテーテルのハブの中心に 1 × 106セル (セルの数は変数にあります) を含む懸濁液 50 μ L をピペットします。懸濁液はすぐに吸引されます。その後、1 mL 注射器を接続し、肺内の一貫性のある配信を確保するために空気の 300 μ L を分注します。</li>
	<li>ゆっくりカテーテルを削除、挿管のプラットフォームから、マウスを削除、それが麻酔から回復するまで熱パッドの上に置きます。</li>
</ol>3. フローサイトメトリー用肺準備
<ol><li>目的の実験的エンドポイントでケタミン (100 mg/kg 体重) とキシラジン (10 mg/kg 体重) の混合物の皮下注射によってマウスを落ち着いたし、頚部転位によって安楽死させます。</li>
	<li>死体を 70% エタノールに浸漬し、テープを使用して解剖ボード上でマウスを固定します。</li>
	<li>腹側正中切開を行い、軽く胸壁筋肉および腹部臓器を公開するために皮膚を反転します。横隔膜を穿刺、胸腔内を公開するハサミで肋骨を切る。</li>
	<li>3 肺灌流を残して左心室に小さな開口部を切断した後 27 G の針を使用して血を許可する右心室を介して氷冷 PBS の ml の 6-8 倍。肺は血と完全に白にクリアされます。</li>
	<li>肺を取り出し、はさみを使用して小さな断片に葉をみじん切り。2 mL 遠心チューブに肺部分を転送および肺消化バッファーの 1.5 mL でそれを孵化させなさい (RPMI、5% の FCS 150 U/mL コラゲナーゼ ・ 50 U/mL DNase 私)。</li>
	<li>孵化させなさい肺個セット定数揺れと 37 ° C で 30-60 分。</li>
	<li>70 μ m 携帯こし器を通って肺細胞懸濁液を 50 mL のチューブに転送します。滅菌 10 mL 注射器の背面とストレーナーをオフ、15 ml の 2% の FCS と PBS のストレーナーをすすいでください。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心し、上清を吸引します。アンモニウム塩化カリウム (ACK) 溶解バッファーの 1 mL の細胞を再懸濁し、残留赤血球の換散のため室温で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心し 2% の FCS と PBS の 1 mL の細胞を再懸濁します、流れの cytometry の23の目的の汚損のプロトコルに進みます。 注:30 %fcs と 10 %dmso を含む RPMI で別の方法として、セルが可能性があります再停止されると凍結凍結コンテナーを使用して、後で分析。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

肺の肺生理学的および病理学的イベントを研究するには、様々 な試薬の注入のための侵襲的、非侵襲的な気管内挿管法が広く使われている26,27,28,29 ,30,31,32。がん分野で研究者は、気管を使用 (および鼻腔内) 肺上皮細胞における体細胞突然変異を導入する Cre リコンビナーゼ発現ウイルスの注入。P53 floxed マウス7でマウスを飼育している場合 Ad.Cre またはレンチ ウイルスの管理は KRAS LSL G12D マウス、付随して導入された細胞における p53 のノックアウトの発癌性 K ‐ ras の条件付き...

肺がんは男性と女性の両方の1で最大の癌関連キラーではまだまだです。確かに、アメリカの癌協会によると毎年多くの人々 は胸、前立腺および結腸癌の一緒に1のよりも肺癌で死ぬ。肺がんの最も豊富なサブタイプは、非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者の大半が血管新生の主の最初の行設定でプラチナ ベースの化学療法で治療された最近まで、阻害剤2。患者のサブセットのみ未分化リンパ腫キナーゼ (アルク) または ROS1、上皮成長因子受容体 (EGFR) の発癌性突然変異を隠すし、利用可能なターゲット薬3,4と扱うことができます。免疫チェックポイント阻害剤の出現により、今までは、患者の 20-40% だけは免疫療法5に応答が、肺癌患者に新たな希望が生じた。それ故に、さらに研究は免疫チェックポイント療法を微調整し、組合せ治療オプションを調査してこの結果を改善するために必要です。
肺癌の研究、前臨床モデルの広大な配列があります、モデル (ジェム) の条件付きのアクティブ化後、土着の腫瘍が発生するの化学物質や発ガン性物質や遺伝子組み換えマウスによって引き起こされる自発的なモデルを含む遺伝子および/または腫瘍サプレッサーの遺伝子6,7,8の不活化。これらのモデルは、肺腫瘍の開発の基本的なプロセスを調査する特定の値が、繁殖、広範なマウスも必要になります、実験は時間がかかる。したがって、潜在的な阻害を評価する多くの研究はひと肺癌細胞株を免疫不全マウス9注入皮下皮下 (患者由来) 異種移植モデルの利点を取る。
これらのモデルで腫瘍の micromilieu は必要に応じては表されませんしたがって、研究者も使用する同所性同種移植モデルどこ肺実質10、11,12,13に静脈内投与、intrabronchially、または直接に、腫瘍細胞が挿入され、 14,15,16,17,18,19,20。これらのメソッドのいくつかは、技術的に困難な再現して研究者の集中的な訓練を必要とすることは困難です。21ここで我々 は非侵襲的な同所性気管移植による免疫マウス、腫瘍が 3 ~ 5 週間以内に開発して、T 細胞の発現を誘導するために、人間の腫瘍の重要な類似を表わす、適応抑制プログラム死リガンド 1 (PD L1) 腫瘍の細胞。11,12,20マウス腫瘍細胞の使用に由来するジェム モデルと同系の受信者マウスが免疫細胞を含む腫瘍微小環境の適切な研究をします。さらに、体外移植肺腫瘍の遺伝要因の影響の調査を容易にする前に、遺伝子編集 CRISPR/Cas9 技術22のようなツールは使用できます。

<table><tbody><tr><td>家で単離された</td><td>マウス肺腺癌細胞株</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6</td><td></td><td></td>マウス<td>F1 2つの背景の十字のF1を使用することができます（8-12</td></tr><tr><td>週間)129SマウスRPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1640中</td><td>期生命技術</td><td>11544446</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>生命技術</td><td>11573397</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>Life Technologies</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Life Technologies</td><td>11539876</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>11560626</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Ketasol (100 mg/mL Ketamine)</td><td>Ogris Pharma</td><td>8-00173</td><td></td></tr><tr><td>キシラゾール (20 mg/mL キシラジン)</td><td>Ogris Pharma</td><td>8-00178</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyste (22 GA 1.00 IN)</td><td>BD</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>鈍い鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS8260</td><td></td></tr><tr><td>Leica CLS150 LED</td><td>Leica</td><td>30250004</td><td>Fibre Light Illuminator</td></tr><tr><td>Student Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-Free)</td><td>ニューイングランドBiolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I 型</td><td>Life Technologies</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) モノクローナル抗体 (MIH5), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-5982-82</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2a κ アイソタイプコントロール, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-82</td><td></td></tr></tbody></table>

pd l1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

マウス モデルの使用は様々 な疾患の病態生理を研究するため不可欠であります。肺癌に対するいくつかのモデルがあります、モデルだけでなく、移植モデルに設計遺伝子を含みます。ただし、遺伝子組み換えマウス モデルは時間がかかり、高価ないくつかの同所性同種移植モデルが再現しにくいに対しです。ここでは、代替同所性同種移植モデルとして肺腫瘍細胞の非侵襲的な気管の配信方法は記述されています。マウス肺腺癌細胞と同系移植の受信者の使用は、完全にアクティブな免疫システムの存在下で腫瘍を勉強できます。さらに、腫瘍の遺伝子操作は細胞移植になりますこのモデル, 腫瘍の増殖や腫瘍細胞の遺伝子発現の遺伝的要因の影響を研究する魅力的な時間節約アプローチは生理的条件下でプロファイルする前に。それ肺腺癌細胞を示す本モデルを用いた T 細胞サプレッサーの増加レベルを表現は、in vitro における栽培と比較して、自然の環境で栽培されたは死リガンド 1 (PD L1) プログラム。

腫瘍微小環境の PD L1 の発現を刺激するかどうかをテストする気管内腫瘍細胞配信を通じて同所性同種移植モデルを使用しました。したがって、10 週間後腫瘍誘導に Cre リコンビナーゼ発現アデノ ウイルス (Ad.Cre) 配信24土着 KP モデル (KP 細胞) からマウス肺 AC 細胞を分離しました。その後、肺は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) を用いた AC 細胞をラベル付け-気管内配信を介して免疫、同系マウスにそれらにしみ込んでレンチ ウイルス25とがんを表現します。モデルを検証するため、我々 は腫瘍細胞の量が異なるを移植し、生存分析を行った。予想通り、受信者のマウスの生存率の明らかな移植細胞数に相関を示したし、2 x 10 の6セルの受信者に対して 2 週間と 10 週間くらい 2.5 x 10 の5細胞 (図 2 a) の受信者の間生存期間であ...

ここで非小細胞肺癌を勉強する時間とコスト削減モデルとしてマウス肺腺癌細胞の低侵襲同系同所性同種移植モデルについて述べる。

PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

マウス肺腺癌細胞を同種移植片レシピエントに移植する正交性移植により、生理学的条件下で完全に活性な免疫系の存在下での腫瘍形成の研究が可能になる。もちろん、腫瘍は免疫能力マウスに発展し、免疫不全マウスで移植を行う場合ははるかに生理学的です。移植前の腫瘍細胞の遺伝子編集は、このモデルを腫瘍成長および遺伝子発現プロファイルに対する遺伝的要因の影響を研究するための直接的かつ時間を節約するアプローチにする。誘導性オートチソナス肺腫瘍モデルと比較して、この方法はマウスの広範な繁殖を回避し、したがって、以前の肺癌マウスモデルの改良を表す。手順を開始する前に、はさみを使用してカテーテル針の端部を取り除き、カテーテルを針の端に完全に押し込みます。つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、麻酔下の8〜12週齢のマウスの目に軟膏を塗布し、縫合糸に垂直な胸部を持つ挿管プラットフォームを横切って縫合糸の文字列の上切開部をフックします。前肢の間に光ファイバーケーブルを置いて胸を照らし、消毒された平らな鉗子を使って舌を慎重に開けます。白色光の放出を探して喉頭、喉頭蓋、およびアリュテノイド軟骨を見つけます。気管の開口部がはっきりと見える場合は、カテーテルを気管に静かにスライドさせ、分岐を超えて、肺内の肺腺癌細胞の均等な分布を保証する。カテーテルの挿入が非常に滑らかであることを注意してください。抵抗を感じたら、カテーテルを取り外し、気管を再び露出して、マウスの怪我をしないようにします。針をカテーテルから素早く取り出し、カテーテルを通して白色光が光っているかどうかを確認します。気管内のカテーテルの適切な配置を確認するには、カテーテルに水の1ミリリットルの注射器を取り付けます。注射器の水は呼吸に合うように急速に上下に動くはずです。細胞懸濁液を送達する前に、細胞を手で温め、50マイクロリットルの細胞をカテーテルに積み込みます。懸濁液が吸引されるとすぐに、空の1ミリリットルの注射器をカテーテルに取り付け、300マイクロリットルの空気をカテーテルに分配して、肺内の腫瘍細胞の完全な分布を確保する。その後、カテーテルを静かに取り外し、完全な債務が発生するまで監視とヒートパッド上にマウスを置きます。適切な実験エンドポイントの後、70%エタノールに死体を浸し、解剖板に動物を固定します。腹側の正中線切開を行い、皮膚をそっと反転して胸壁の筋肉と腹部の器官を露出させます。はさみを使って横隔膜を穿刺し、肋骨を切り、胸腔を露出させろ。左心室の小さな開口部を切断し、27ゲージの針を使用して、右心室を通して肺を3回穿孔し、1回の注入ごとに6〜8ミリリットルの氷冷PVSを使用します。最後の灌流の後、肺は完全に血液を取り除き、白く見えるはずです。収穫後、はさみを使用して肺組織を小片にミンチします。肺の断片を摂氏37度で30~6

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がん研究

確実に免疫不全マウスの坐骨神経にルシフェラーゼタグ付きヒト悪性末梢神経鞘腫瘍細胞を移植する方法が説明されています。研究グループに動物のランダムな分離のための腫瘍移植と基準の適切な設置を実証するために生物発光イメージングの使用についても説明します。...

のために人間のルシフェラーゼ-タグ付き悪性末梢神経鞘腫瘍細胞の同所Xenografting in vivoで</em候補治療薬の>テスト

このビデオでは、肺腺がん細胞のPD-L1発現を研究するためのフローサイトメトリー分析のためのマウス肺細胞懸濁液の調製について説明しています。...

フローサイトメトリーのためのマウス肺調製:フローサイトメトリー解析のための肺組織からの細胞懸濁液の生成(英語)

このビデオでは、膵臓がんの発症のために、がん性ドナーから非がん性レシピエントマウスの膵臓に腫瘍断片を同所性に移植するための段階的な外科的方法を説明しています。同所性に移植されたPDACは、従来の皮下(SC)モデルよりも正確にヒトの膵臓がんの組織微小環境を再捕捉できます。...

同所性ホモグラフト腫瘍移植:膵臓腫瘍マウスモデル作製技術

事前の負傷で気道をコンディショニングすることでマウスの肺に肺癌細胞の同所性同種移植を大幅に強化する手法について述べる。このアプローチは肺微小環境、転移播種、肺癌併存、間質相互作用の研究にも適用可能性があり、派生した異種移植片をより効率的に患者を生成します。...

同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

実験マウスの同所性同種 PDAC 移植の診療には、腫瘍免疫微小環境のプロファイリングを目指しています。腫瘍は、手術を介して注入したがんです。200-600 mm3の大きさの腫瘍は、収穫され、異なる蛍光標識抗体を用いて免疫マルチ マーカー FACS...

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

マウス由来膵管腺癌細胞株の超音波誘導移植のためのプロトコルを原在腫瘍部位に直接記載する。このアプローチは、注射の2〜4週間以内に超音波スキャンによって検出可能な膵臓腫瘍をもたらし、外科的整形トピック移植と比較して腹壁の腫瘍細胞播種の割合を有意に減少させた。...

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

膵管腺癌(PDAC)の同系マウス同所性同種移植片は、疾患サブタイプの生物学、表現型、および治療反応を再現します。迅速で再現性のある腫瘍進行により、前臨床試験で広く使用されています。ここでは、これらのモデルを生成するための一般的な方法を示し、同系マウスPDAC培養物を膵臓に注入します。...

膵臓癌モデルへの同系マウス同所性同種移植片

本プロトコルは、膵管腺癌(PDAC)および正常な膵管上皮細胞を人工多能性幹細胞(iPS細胞)に再プログラミングすることを記述する。レンチウイルスの調製から安定なiPS細胞株の樹立まで、最適化された詳細な手順を段階的に提供します。...

膵管腺癌の多能性へのリプログラミング

この研究は、蛍光A549-iRFP細胞の多細胞スフェロイドの肺内接種に基づく同所性非小細胞肺がん(NSCLC)モデルを示しています。このモデルは、長波長蛍光の動的 in vivo モニタリングに従って、臨床NSCLC病期を再現し、シスプラチンに応答します。...

疾患進行を模倣し薬物活性を予測する非小細胞肺癌の同所性異種移植モデルの構築

肺がんの新しい治療法を開発する上の主な課題には、局所疾患が転移性疾患に進行する際の腫瘍微小環境のモデル化が含まれます。ここでは、肺がんの同所性同系モデルを確立する簡単な方法を説明し、経時的な疾患の in vivo...

肺癌の同系同所性マウスモデルを生成するための低侵襲法

学ぶ、マウス肺腺がん細胞の同所性同種移植モデル。免疫能を持つマウスで腫瘍形成を研究し、遺伝子編集による遺伝的要因の影響を解析する効率的な手法です。

PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

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