成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

この方法は、成体マウスの感覚ニューロンにおける遺伝子発現を操作するための生体内遺伝子導入技術を提供し、将来の哺乳類のエクソ再生の研究に役立てることができます。この技術の主な利点は、労力と時間が少なくて済み、標的遺伝子の過剰発現とノックダウンを同時に、または別々に行うことができることです。この手順を開始するには、麻酔をかけたマウスの腸骨稜の両側に細かいマーカーで印を付けます。

腸骨稜の2点を結ぶ線を引いて、L5 DRGの位置の識別を容易にします。次に、マイクロハサミで腰の正中線に沿って3センチの切開を行います。その後、L3からS1の棘突起から、多裂筋や腰部筋などの傍棘筋を剥離し、L4-5とL5-6の筋膜接合部を露出させます。

次に、マイクロロンジャーを使用して、L4-5とL5-6の筋膜ジョイントを取り外します。続いて、L4とL5の左神経弓を切除し、DRGの背側を露出させます。DRG注入の場合は、DNAプラスミドまたはRNAオリゴをガラスキャピラリーピペットにロードします。

次に、キャピラリーガラスピペットの先端を慎重にDRGに挿入し、細胞内マイクロインジェクション分注システムを使用してDNAプラスミドまたはRNAオリゴの1マイクロリットル溶液を徐々に注入します。エレクトロポレーションの場合は、ターゲットDRGを電極で優しくつまみ、エレクトロポレーションシステムで5つの正方形の電気パルスを印加します。その後、筋肉を閉じ、次にナイロン縫合糸で皮膚層を閉じます。

DRGエレクトロポレーションの2〜3日後、マウスを腹腔内に麻酔し、手足をコルクボードにテープで固定し、正中線に沿って左側に0.5センチメートルの切開を行います。次に、大殿筋や梨状筋などの筋肉を縦に切ります。次に、大坐骨孔と坐骨神経ノッチの間の坐骨神経の部分を露出させます。

マイクロサージェリー鉗子で神経を12秒間押しつぶし、押しつぶした部位にナイロン製のエピニューラル縫合糸で印を付けます。その後、ナイロン縫合糸で筋肉と皮膚の層を閉じます。増殖後、解剖顕微鏡下でマイクロハサミとマイクロ鉗子を使用して、神経根と坐骨神経と一緒にDRGを慎重に分離します。

次に、坐骨神経を摂氏4度で一晩中4%PFAで直接移植します。解剖顕微鏡で蛍光標識された感覚軸索を画像化および測定するには、固定された坐骨神経に付着した組織と膜をマイクロハサミとマイクロ鉗子で慎重に剥がします。次に、PVSで神経を3回洗います。

次に、坐骨神経をスライドに置き、まっすぐに保ちます。神経の周りに80マイクロリットルの退色防止溶液を追加し、その上にカバースリップを置きます。マウントされた組織全体を圧力で平らにします。

その後、平坦化した組織を、モザイク取得および画像処理用のアクセサリーを装備した倒立落射蛍光顕微鏡の下に置きます。再生した軸索の長さを測定するときは、坐骨神経の蛍光標識された軸索をすべて、潰れた部位から遠位の軸索の端まで追跡します。現在の生体内エレクトロポレーション法を適用して軸索再生を研究すると、坐骨神経が平らになり、画像化されました。

特徴的な軌道と認識可能な遠位軸索端を持つ再生されたすべての軸索は、縫合糸の結び目で示される粉砕部位から追跡することができます。白い矢印、矢印、星は、3つの特徴的な軸索の端を示しており、それらはすべて押しつぶされた場所から伸びています。さらに、DRGをEGFPプラスミドでエレクトロポレーションし、脊髄を採取しました。

EGFPで標識された背側縦軸索は、脊髄で、縦方向と矢状の両方の投影画像で画像化され、同定されました。これは背柱の軸索の詳細な図であり、これは背根エントリゾーンの軸索の詳細な図です。この画像は、背側柱内のEGFP標識軸索の矢状突起を示しています。

あるいは、共焦点画像を顕微鏡視覚化ソフトウェアで処理して、3D画像を再構築することもできます。この手順を試みるときは、L4とL5 DRGを正しく配置し、坐骨神経を突き刺さずに硬膜に結び目を作り、潰れた部位に縫合糸の結び目をラベル付けすることを覚えておくことが重要です。この技術の開発後、この技術は、軸索再生の分野の研究者が、PNSに必要な遺伝子、天然の軸索再生、または生体内の成体マウスの再生をさらに促進できる遺伝子を探索する道を開くことになります。