生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

体内の 2 光子イメージング新生児マウスの大脳皮質をイメージングするためのプロトコルを提案します。このメソッドは、皮質ニューロン、神経ダイナミクスと疾患モデルのダイナミクスの変化を制御する分子メカニズムの発達のダイナミクスの分析に適しています。

この方法は、神経科学、特にニューロンソケット形成に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者が生きている新生児マウスの個々のニューロンの形態学的変化を分析できることです。麻酔を受けた出生後5日目の子犬から始まり、尾のピンチテストに対する反応がない場合にのみ進みます。

まず、頭皮を70%エタノールで拭いて滅菌します。その後、70%エタノールで殺菌したハサミを使用して、頭蓋骨を覆う皮膚の約20平方ミリメートルを除去する。次に、皮質緩衝液に浸した無菌鉗子と清潔な綿棒を使用して、頭蓋骨の筋膜を取り除く。

画像化する領域を避けながら、切開された皮膚表面に組織接着剤を塗布し、出血を止めるために負荷チップを使用してください。別の加熱パッドに子犬を置き、摂氏37度に設定し、麻酔から回復させます。組織接着剤が乾燥し固まるまで約30分待ちます。

組織接着剤が乾燥したら、再麻酔マウス上で頭蓋窓の調製を開始します。頭蓋骨に皮質バッファーの1滴を適用し、その後、慎重に頭蓋骨の直径1ミリメートルの領域を開くために滅菌カミソリブレードを使用して、デュラをそのまま残します。脳表面を湿らせた保つために皮質バッファーを適用します。.

皮質バッファーに浸したゼラチンスポンジの小片を使用して、出血を止めます。新鮮な部分を使用して頭蓋骨切除術の片側を圧縮し、硬膜に触れることなく硬膜表面から任意のバッファーと血液を排出します。これは、ウィンドウをクリアする最も重要な手順です。

硬膜は損傷を受けていない必要があり、ブラシは露出した硬膜から取り除く必要があります。次に、ピペットチップを使用して、皮質緩衝液に溶解した1%低融解アガロースの薄層を適用する。円形の3ミリメートルのガラスカバースリップをアガロースゲル層に塗布します。

カバースリップとアガロースゲル層の間にアガロースゲルを過剰に注ぎ込んで、すべての気泡を取り除きます。ピンセットを使用して余分なゲルを取り除き、カバースリップの下から突き出します。セメントパウダーとセメント液を混ぜます。

ピペットチップを使用して、固まる前に頭蓋骨に混合物を適用します。次に、歯科用セメントを使用して頭蓋骨にカスタムメイドのチタンバーを取り付けます。チタンバーを合わせ、カバースリップを平行にして画像を簡単にキャプチャします。

露出した頭蓋骨を歯科用セメントで覆います。次いで、皮下鎮痛を注射する。歯セメントが固まるまで1時間、摂氏37度のヒートパッドの回復ケージに子犬を置きます。

イメージングを開始するには、まず2光子レーザー波長を設定します。RFP励起には、1000ナノメートルの波長を使用してください。カバースリップの表面を70%エタノールで拭きます。

麻酔付きの子犬を、チタンバーを使用して、イメージングステージのチタンプレートに取り付けます。ゴニオメータステージを使用して、カバースリップが対物レンズに平行になるようにヘッドを調整します。37°Cに設定した加熱パッドを使用してイメージング中に子犬の体温を維持し、イソフルラン濃度を0.7%から1%に下げ、2つの光子顕微鏡の20倍の対物レンズの下にイメージング段階を置きます。

カバースリップに1滴の水を塗ります。Zスタックイメージを1.4ミクロン間隔で取得するようにソフトウェアを設定します。レイヤ 4 ニューロン イメージングの場合、Z 幅を 150 ~ 300 ミクロンに設定して樹状モルフォロジー全体をイメージします。

低速スキャンと平均を使用して、神経形態を示す鮮明な画像を取得します。樹状形態全体を取得するのに通常20分以上かかります。この画像は、P5 pupの層4皮質ニューロンの代表的なZスタック画像を示しています。

矢印は、分析するニューロンを示します。デデンドライトがぼやけたニューロンは、分析から削除する必要があります。この画像は、前の画像で示されたニューロンのより高い拡大画像を示しています。

青い矢印は、次の時間ポイントで引き込まれる樹状の先端を示し、小さな白い矢印は隣接するセルの軸索を示します。4.5時間後、青い矢印を持つ樹状の先端が引き込まれ、黄色の矢印を持つ樹状の先端が細長くします。代表的な樹状形態再構成がここに示され、ここで見られる切断された樹状突起を示すニューロンは、分析から除外されるべきである。

この手順を試みる間は、プロセス中に硬膜をそのままにしておくことが重要です。この手順を用いて、推進画像化のような他の方法は、新生児脳におけるニューロン活動パターンに関連する追加の質問に答えるために行うことができる。