食品および環境試料からのサルモネラの準メタゲノム解析
October 25th, 2018
ここでは、協調検出およびサルモネラの quasimetagenomic シーケンスを通じてサブタイピングの食糧および環境内細菌叢解析からの DNA のサンプルを準備するためのプロトコルを提案する.併用文化濃縮、原因菌分離 (IMS)、複数の変位の増幅 (MDA) により、サルモネラ食糧および環境試料からゲノム DNA の効果的な濃度。
この方法は、食品サンプルからサルモネラ菌を検出し、遺伝的フィンガープリントを介して株レベルまで病原体を同定するために使用することができる。この技術の主な利点は、サルモネラ検出とサブタイピングを単一のワークフローに組み合わせ、サルモネラ菌汚染食品サンプルから病原体の指紋までのターンアラウンドタイムを大幅に短縮することです。まず、無菌の実験室用ブレンダーバッグ内に25グラムの食品サンプルを作り込み、必要に応じて濃縮ブロスでスポンジを無菌で湿らせ、事前に決定された表面を横切って引きずり、ブレンダーバッグの中に入れて環境綿棒を準備します。
実験室用ブレンダーを使用して、各サンプルを225ミリリットルのRV濃縮液と十分に混合します。その後、42°Cで4〜21時間インキュベートします。この後、袋のろ過された側から濃縮液の50ミリリットルのサブサンプルを収集します。
次に、サブサンプルを100回gで10分間遠心する。慎重に10分間3,000〜6,000倍gで新しい50ミリリットル遠心管と遠心分離機に上清を移します。上清を捨て、BPWの5ミリリットルでペレットを洗います。
BPWの5ミリリットルでペレットを再懸濁します。まず、MDAキットから氷上でサンプルバッファーと反応バッファーを解凍します。BPWに再懸濁細胞1ミリリットル、マイクロ遠心チューブに抗サルモネラビーズ20マイクロリットルを入れる。
マイクロ遠心チューブを回転ミキサーに室温で30分間置きます。この後、3分間磁気スタンドにチューブを置きます。ビーズをペレットに濃縮するために、磁気ラックを数回反転します。
チューブを磁気ラックに保管し、吸引し、上清を捨てます。次に、チューブに1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。チューブホルダーをラックから取り出し、チューブホルダーを数回反転して、非特異的に結合した細菌を複合体から取り除きます。
3回目の洗浄後、上清をチューブから吸引し、廃棄する。次に、マグネットラックからチューブを取り出し、1秒間遠心分離します。その後、残りの洗浄バッファーを取り外す前に、3分間磁気ラックにチューブを置きます。
9マイクロリットルのサンプルバッファーにビーズサルモネラ錯体を再中断し、チューブを摂氏95度で3分間インキュベートします。氷上で複合体を冷却した後、反応バッファーの9マイクロリットルと酵素ミックスの1マイクロリットルを追加します。テキストプロトコルに従ってサーマルサイクラーでチューブをインキュベートし、氷の上でチューブを冷却します。
次に、フルオロスペクトロメーターの器具を用いて、サンプルのDNA濃度と純度を測定します。最終製品は、将来の実験のためにマイナス20°Cで保存してください。テキストプロトコルに従って、サンプルごとに18マイクロリットルのPCR混合物を調製します。
その後、MDA製品を上下に軽くピペットで混ぜます。PCR混合物にMDA製品懸濁液の2マイクロリットルを加えます。最適化されたリアルタイム PCR プロトコルを使用して、テキスト プロトコルに従ってリアルタイム PCR を実行します。
テキストプロトコルで指定されたようにMDA製品にバッファー溶液および試薬を追加し、その結果40マイクロリットルのシーケンシング準備されたMDA製品を新しいプレートに移し、20マイクロリットルのPCR精製ビーズを各ウェルに加えます。次に、プレートを室温で10分間インキュベートする。その後、80%エタノールでビーズを洗浄し、12分間乾燥させます。
乾燥ビーズを再懸濁液バッファーの53マイクロリットルに再懸濁し、室温で2分間インキュベートします。最後に、メーカーの指示に従ってライブラリを希釈し、プールします。本プロトコルでは、サルモネラDNAの標的量評価をリアルタイムPCRにより行った。
サルモネラ菌汚染鶏胸肉の2つのブランドの代表的な結果は、サンプルDNAが効果的に増幅されたことを示すマイクロリットル当たり701.54から945.86ナノグラムの範囲であった。この手順を試みる間は、IMSビーズを慎重に洗浄および取り扱いし、MDA試薬および製品を汚染物質から解放し、清潔なフードを維持することを忘れないでください。開発後、この技術は、食品の安全性と公衆衛生の分野の研究者が、食品サンプル、製品環境およびサプライチェーンにおけるサルモネラ汚染物質の迅速かつ高解像度の追跡を探求する道を開いた。
食物媒介性病原体を使用することは非常に危険であり、個人的な保護具の着用や良い実験室の慣行に従うなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この研究は、クアジメタゲノムシーケンシングを使用して食品および環境サンプルからサルモネラ菌を効率的に検出およびサブタイピングするための新しいプロトコルを提示します。培養濃縮、免疫磁気分離、および複数の変位増幅を統合することで、サンプル採取から病原体同定までの時間を大幅に短縮します。
主要な研究要素
研究領域
- 食品安全性
- 微生物検出
- 病原体サブタイピング
背景
- サルモネラ菌は食品由来疾患の主要な原因です。
- 迅速かつ正確な検出方法は公衆衛生にとって重要です。
- 既存の方法は多くの場合、ワークフローの複数のステップを含み、結果として所要時間が長くなります。
使用した方法
- クアジメタゲノムシーケンシング
- 免疫磁気分離（IMS）
- 複数の変位増幅（MDA）
主な結果
- 様々なサンプルからのサルモネラ菌のゲノムDNAの効果的な濃縮。
- サンプル採取から病原体フィンガープリンティングまでの迅速な所要時間。
- 食品供給環境におけるサルモネラ菌の高解像度トラッキング。
結論
- この技術は、食品安全性の文脈におけるサルモネラ菌検出の効率を向上させます。
- 汚染の追跡と公衆衛生の保護のための価値あるツールを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid detection and strain-level identification of foodborne pathogens like Salmonella are critical for timely risk assessment and supply chain intervention in food safety programs. This quasi-metagenomic approach combines enrichment, immunomagnetic separation, and multiple displacement amplification to deliver both detection and genetic fingerprinting in a single workflow, reducing turnaround time from days to hours. The method supports predictive confidence in contamination source tracking and enables high-resolution monitoring across production environments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of Salmonella presence in complex food matrices through selective pathogen enrichment and DNA amplification.
- Operational Value: Reduces background noise from competing microbiota, improving target signal clarity for downstream analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates amplified Salmonella DNA suitable for high-throughput sequencing or qPCR, supporting scalable pathogen screening workflows.
- Operational Value: Standardizes sample preparation across diverse food types (e.g., sprouts, spices, meats) and environmental swabs, enhancing assay reproducibility.
- Scientific Value: Facilitates strain-level discrimination via genetic fingerprinting, enabling precise contamination source tracking in outbreak investigations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant detection capability for Salmonella, a major foodborne pathogen, supporting translational food safety research.
- Operational Value: Bridges environmental sampling and laboratory analysis, enabling continuity from field collection to molecular characterization.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by confirming pathogen presence and load before investing in intervention studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the food safety testing continuum, supporting early hazard detection, strain characterization, and data-driven decision-making in HACCP and environmental monitoring programs.
- Discovery Biology: Confirms Salmonella presence and enriches target pathogen DNA from complex samples, enabling hypothesis testing about contamination sources.
- Screening: Delivers quantifiable DNA output via MDA, compatible with sequencing or qPCR for scalable screening applications.
- Analytics: Generates amplifiable DNA suitable for real-time PCR quantification and sequencing-based fingerprinting, enabling comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Links environmental detection to actionable public health insights through strain-level identification and load assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular sample preparation workflow adaptable to multiple food matrices and environmental surfaces, reducing method redevelopment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pathogen detection by reducing false negatives through target enrichment and amplification.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized IMS and MDA steps, minimizing variability in pathogen recovery.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in food release and environmental monitoring by shortening time-to-result.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of interventions by providing rapid, high-resolution contamination data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunomagnetic separation techniques and careful bead handling to avoid loss of target complexes.
- Depends on access to thermal cyclers, magnetic racks, fluorospectrometers, and sequencing or qPCR platforms for downstream analysis.
- Necessitates standardized washing protocols to reduce non-specific binding and ensure specificity of Salmonella capture.
- Requires adaptation of enrichment duration and broth type based on food matrix characteristics to optimize pathogen recovery.
- Practical limitations include potential inhibition from food-derived compounds, necessitating DNA quality checks before sequencing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
Sample Preparation
1:39
Immunomagnetic Separation (IMS) and Multiple Displacement Amplification (MDA)
3:37
Real-time PCR and Library Preparation for Quasimetagenomic Sequencing
4:52
Results: RT-PCR Amplifies DNA from Two Brands of Salmonella Contaminated Chicken Breast
5:19
Conclusion
