Name: 再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ蚊とハエへのdsRNAマイクロインジェクション手法。Aedes aegyptiとMusca domesticaを用いて遺伝子発現と産卵量を評価し、バイオ殺虫剤研究に応用可能な再現性の高いプロトコルを確立する。

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著者に感謝花陽有元 (米国海軍)、ダナ ・ ジョンソン、ルーシー李とロキシー白 (USDA-ARS) のデータ収集と分析に役立ちます。我々 もありがとう夫妻ぴあ Olafson (USDA-ARS) や柯呉 (フロリダ大学) 原稿とニクラウス ・ Hostettler (フロリダの大学) の批判的検討の顕微鏡映像を撮影します。資金は米国農務省、海軍・海兵隊保健センター、戦争戦闘機の保護の展開プログラムの WII-141 C プロジェクトによって提供されました。資金提供者は、設計または研究の方向、原稿の開発の役割をなかった。

1. 昆虫準備
<ol><li>いくつかの時間または 2 分露出を CO2 4 ° C でそれらを低温と、注射の前に 4 ° C で蚊を麻酔します。風邪は麻酔注射の前に h 4 ° C 2\u20123 で飛ぶ。蚊やハエが交尾産卵応答変数である場合を確認します。 注: 蚊 anesthetization メソッドが種とひずみに依存などアカイエカヒトスジシマカネッタイシマカより冷たい anesthetization から早く回復、そのため CO2ノックダウンが望ましい。</li>
	<li>氷の上慎重にステージ蚊やソフト鉗子を使用して腹レイアウトによってハエは顕微鏡スライド ~0.5 cm を公開しました。標準スライド 6 蚊の 2 つの行が保持できるまたは 6-7 家が飛ぶ。蚊やハエ スライド処理を支援するために明確なスライドの左または右の端に 1-1.5 cm を空けます。</li>
	<li>注射の準備ができるまで大規模なペトリ皿の 4 ° C で段階的な昆虫のスライドを維持します。 注: 上限を設定する排気に悩まされるから昆虫を防止できますシャーレの蓋に穴を掘削します。皿の底に固定されているガラス管のカップルにスライドを配置すると、シャーレから除去を緩和します。</li>
</ol>2. 昆虫注入
<ol><li>Estep et al.による記述で dsRNA を準備します。5と Sanscrainteら9. 汚染物質の自由、dsRNA を吸光度 260 nm と260 × 希釈係数 × 40 μ g/mL で計算する RNA 濃度を測定する分光光度計を使用して示すことができるかどうか。</li>
	<li>冷麻酔蚊とハエ (手順 1.1-1.3 と図 1を参照) の注射を実行するチル テーブルまたは浅いアイスペールを介して顕微鏡とマイクロインジェクター、その実力を解剖を設定します。</li>
	<li>針の引き手と微細先端にガラス管を引く (設定: ヒーター = 15 ユニット、ソレノイド = 4 A)。 注: 詳細については製造元の材料表を参照してください。</li>
	<li>製造元の指示と休憩針先あたりマイクロインジェクターに一対の鋭いポイントを生成する鉗子でつまんでキャピラリー針を配置します。 注: 推奨針開口部のサイズは、〜 150 μ m の蚊、イエバエの ~ 250 μ m です。</li>
	<li>マイクロインジェクター目的の配信のボリュームを設定します。〜 50 nL 因数から半月の動きは容易にオブザーバブルと蚊のマイクロインジェクションにお勧めです。利用可能な場合は、高速インジェクションの設定を有効にします。充填し、ヌクレアーゼ フリー水を追放して 3 回針をすすいでください。</li>
	<li>このような蚊の必要な投与量と 500 nL 100\u2012150 nL を提供することを提供する濃度で注入希望家のハエの線量のためのソリューションを準備します。 注: 初期用量を提案した: 各蚊のため 1 μ g と各イエバエ5,9の 5 μ g。</li>
	<li>必要に応じて蚊 (可視化支援) にローダミン B を 3.0 μ g/mL の最終的な集中にソリューションに追加できます。 注: 染料腹部・胸部の交差点で腹側表面に透明に近いキューティクルを介して注入後そのピンクの色で明確に表示になります。</li>
	<li>きれいな面 (パラフィン フィルムの一部) などに挿入し、任意の空気を吸うことがなくガラス針に描画ソリューションの 3-4 μ L をピペットします。液体を針から分配し、優しく繊細なタスク ワイパーで水滴を拭き取って開始まで繰り返し注入ボタンを押します。 注: インジェクターの一部のモデルには、注射器のバックフィルが必要ですが、材料のテーブルで参照されているインジェクターはしません。</li>
	<li>超微細ポイント マーカーを使用して、ハッシュ マーク 〜 1 mm 離れて始めて液体メニスカスから針のシャンクを描画します。半月の動きを可視化する支援、ソリューションが噴射中に蚊を入力したことを確認します。</li>
	<li>チル テーブルまたは氷 (図 1) を針の下で蚊やハエ (1.2-1.3 の手順で準備) としてのスライドを設定します。確保する顕微鏡の視野の針でソリューション メニスカスを参照してくださいに十分に広いです。</li>
	<li>蚊の針 mesokatepisternum (図 2 a) の中央 3 分の 1 を合わせ、穿刺針の先端を使用してキューティクルが優しく反対側に配置される鉗子針に対して蚊をブレース、マイクロインジェクター マイクロメータ。</li>
	<li>家のハエの mesopleuron (図 2 b) 針を合わせ、針に対してフライを補強しながら穿刺針の先端とキューティクルが優しく。</li>
	<li>優しく蚊の針の挿入または先端が正中線を通過するまでに体を飛ぶ。 注: 多くの場合あまりにも浅い針を挿入する昆虫のうち注入された液体ビーズで結果 (2.15 の手順を参照してください)。</li>
	<li>針で液体メニスカスの動き見ながら液体の適切な量を注入するまで注入ボタンを押します。蚊の場合 50.6 nL 因数に設定、〜 100 の 2 X を押して nL または 3 X 〜 150 nL。家のハエの ~ 500 nL が挿入されたまで注入ボタンを押す (すなわち、 69 の nL 因数に 483 の 7 X を押して nL)。</li>
	<li>半月板が動かない場合ゆっくりと蚊をスライドまたはメニスカスの動きを見ながら針を飛ばします。この注射は、針除去またはメニスカスが移動する失敗したかどうかにキューティクルから注入する溶液のビーズの一部として昆虫を破棄する場合、うまくいきませんでした。</li>
	<li>10-15 のグループに正常に挿入された蚊かハエ 3.5 oz カップを保持する 5 のグループに転送します。チュールや網でカバーし、室温で回復します。</li>
	<li>蚊やハエが回復 (1-2 h) が後、10% ショ糖液を浸した綿球をそれぞれ保持カップを反転します。 注: 砂糖の食事10に簡単にアクセスを提供することによって生存のショ糖綿エイズの上にカップの反転。</li>
	<li>手順 2.5 注入ソリューション間のように針をすすいでください。注入し終わったら、破棄は適切なシャープス コンテナーの針を使用します。</li>
</ol>3ネッタイシマカの死亡率と産卵の生物検定。
<ol><li>注射後 3 日間は、10% ショ糖を蚊を提供し、目に見えて死んだ蚊の数を記録し続けます。</li>
	<li>新鮮な血 (すなわち、 ネッタイシマカの牛) と熱を湯浴で 60 ° C (コラーゲン ソーセージケーシング) など ≤12 インチの人工膜を入力します。</li>
	<li>簡単にローリング ペーパー タオルの上で膜を乾燥し、向こうに透明なカップを保持している 3.5 オンスのチュール キャップ。栄養強化のため、ケーシング表面に人間の揮発性物質を残してきれいに素手で暖められた血のソーセージ、phagostimulant としてまたはハンドルを加熱後 1 mm ATP 血をスパイクします。</li>
	<li>吸血後、~ 24 h の産卵カップに転送する前に残りの部分に蚊が持株のカップの上に 10% ショ糖溶液を浸した綿球を交換でき。</li>
	<li>記入コンストラクト産卵カップ クリア 3.5 オンス バイオアッセイ カップ 〜 30 mL の脱イオン H2O と種子発芽の紙を置くこと (~ 4 cm と 5 cm 長い垂直に尾根) 側 (図 3 a) に対して、カップの下にあります。.チュールや網でカバーし、チュールやネット キャップで (~ 1 cm) の小さなスリットをカットします。</li>
	<li>24 h 後の吸血で保持カップのチュール キャップ (~ 1 cm) の小さなスリットをカットし、供給正常に個々 の女性のみを転送-腹部で目に見える血の塊と-産卵カップ (1 女性/産卵カップ) に優しい口吸引によって。10% ショ糖飽和コットン ボールを持つ産卵キャップの小さなカットをシールします。</li>
	<li>完全に死亡率を追跡しながらプレハブハウス蚊を許可する 5\u20127 日 〜 27 ° C でカップを保持します。解離の範囲の下に卵をカウントします。</li>
</ol>4.イエバエにおける死亡率と産卵バイオアッセイ
<ol><li>注射後 3 日間は、引き続き 10% ショ糖をハエを提供し、目に見えて死んだハエの数を記録します。</li>
	<li>投与後 3 日間は、簡単にすべてのハエとコップの底で動かず、ホールディング カップ以上の CO2を調剤ポリエチレン管を置くことによってハエを麻酔します。</li>
	<li>オープニング (10 cm、図 3 b) をカバー メリヤス袖付き 4 L プラスチック瓶から成るきれいなケージにハエを転送します。ハエと水とグラニュー糖の混合物、粉ミルク、乾燥卵黄、8:8:1 の比率は (ボリューム) で 4 日間、死者の取り外しの記録と毎日就航します。</li>
	<li>重量で 25% ペレット飼料の 75% 小麦ふすまの混入による新鮮なハエ幼虫飼育中の乾燥食材を準備します。(うち一滴の水を絞ることがやっとできる) まで水分 62% に到達する水を追加します。</li>
	<li>上記の新規メディアの幼虫の 1:1 混合物から 2.5 cm 径のボールを準備し、幼虫の中を飛ぶ「使用」(中にハエが以前背地性)。ブラック コットン布の正方形でボールをラップ、中の液体は浸透するまで軽く絞るし、ボールの周りの場所に布を保持するためにゴムバンドを使用します。</li>
	<li>60 mL カップにボールを入れて、5 h (図 3 b) のフライの檻の中に置きます。</li>
	<li>リンスの卵を産卵ボールを切り、布のひだの下から卵が削除されていることを確認します。クラスターを混乱させると、ピペットと卒業 20 mL の遠心管に移して卵を振る。</li>
	<li>卵は解決し、卒業管内定住卵のボリュームに注意してくださいされるまで待ちます。定住卵のボリューム X 20 までボリュームをもたらすに十分な水を追加します。水プラス卵の合計量を記録します。</li>
	<li>電磁攪拌棒または激しく攪拌しながら水と卵の懸濁液を混合しながら (切断先端末) 1 mL ピペット先端部を使用して、一連のラインであらかじめ湿らせた黒い布の部分に水と卵懸濁液 0.5 mL を分注します。解剖顕微鏡の下で卵をカウントします。</li>
	<li>手順 4.9 を 2 回繰り返します。カウントのいずれかの深刻な外れ値の場合 (すなわち、によって他の 2 つのカウントとは異なります > 35%)、4 カウント、外れ値を無視します。</li>
	<li>サンプル当たりの卵数の平均を計算し、卵/mL の懸濁液の数 2 でこの値を乗算します。ステップ 4.8 から懸濁液卵の量によって得られる卵/mL 値を乗算します。これは卵の総数の見積もりです。</li>
</ol>

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</ol>

すべての著者は、従業員またはアメリカ合衆国農務省や国防総省の請負業者です。この原稿は、パブリック ドメインの法律によって公務の過程で制作されました。見解は著者の意見を表して、アメリカ政府による公式の位置や支持を表していません。商用製品の言及は、推奨される使用法ではありません。

マイクロインジェクション、dsRNA または他の biorationals (すなわち農薬、ウイルス、microsporidia) を配信する貴重な実験手法です。多くの実験室は、マイクロインジェクションを実行注入する正確な量はしばしば不明確配信システムの技術的な制限により配信ボリュームが直接測定11ではありません。配信ボリュームと濃度は、EC50 または IC50 など標準的な毒性学的措置の計算を許可する重要なパラメーターまたは最小限の効果を定義する用量5,16。これは大人の昆虫、供給することによって配信が常にされない目的の粒子の全身投与による、腸を渡る実際の線量は不明5で RNAi を用いた機能研究で特に重要です。
マイクロインジェクション プロシージャは最初に挑戦的なことができますが、速度と配信の精度の急速な向上、練習と忍耐によって実現しました。自体注射の手順を習得することは時間の投資が、再現可能な結果との傷害死亡、一度プロシージャが生成する < 3%。能力 300 蚊のできるように注入を増加または一日飛ぶ注射成功の比率が増加します。
マイクロインジェクションの課題の多くは、使用されている針が原因です。適切な毛管針休憩ポイントと先端の角度を決定するプロシージャの挑戦的な側面は、特定の種の最も効果的な開口部のサイズを決定するためにいくつかの試行錯誤が必要です。蚊マイクロインジェクション (〜 150 μ m) の最も有用な細針が小さすぎてすぐにハエ ハエ (~ 250 μ m) の作品が小さい蚊に広範囲への傷害の損傷を引き起こすことを開く大きめの針では逆に中に、注入されるより大きい容積を提供受け入れられない注入死亡。先端が鈍が壊れて針は難しい組織の損傷および死亡率の増加のないキューティクルを介して取得します。虫規模や組織の部分が詰まることが針、実験の経過ので、交換が必要な場合を引いたいくつかの針を持っていると便利です。我々 は困難な針を交換するのではなく、詰まったまたは汚された針をオフにしようとする時間を過ごすのために簡単だ発見しました。
(2.14 2.15 の手順を参照してください)、失敗した注射を削除できるように、虫に入る注射液を観察することが重要です。ローダミン B の追加注入ソリューションは、冷段昆虫が適切な投与量を受け取るし、(手順 2.7 参照) の練習中に特に便利ですように明確な視覚を提供します。
紹介注入と産卵した検定方法が遺伝子を正常に誘導しているアダルトAe ネッタイシマカとイエバエ二本に設計されたに対する種特異的なリボソーム ノックダウンで測定可能な表現型の影響。(図 4および図 5 a) の成績証明書。また、正確に個人に microvolumes を提供するこのメソッドの機能は、材料の少量生成する用量応答曲線 (50 と低い ng;図 5 b)。これは特に有用で Sirna スクリーニングなどの方法または二本、これらの分子の大量に生産としては、コストが高くなることができます。
このメソッドは、注入による配信バッファーが無害であることを確認した後 (ウイルス、細菌、microsporidia) 生物学的製剤または化学殺虫剤を注入する変更できます。配信ボリュームが集中生産、昆虫の大きさによって制限されるためのソリューションをテストは重要です。
DsRNA の有効性を十分に評価、致死の表現型が子孫でマニフェスト可能性がありますのみ産卵を追跡する必要は。ここで示す、ブロデリング後女性Ae ネッタイシマカを別々 に保持個々 クラッチ サイズ決定でき、同じ個人でさらにテストを行うことができます (すなわち、遺伝子発現研究、産卵の下流。追加栄養生殖サイクル、組織の特定の打撃) 遺伝子発現など他の対策と生殖出力を関連付けるため。イエバエは一般的に、グループ対応でプレハブハウス、レイアウトする分離妊娠ハエを駆り立てることは非常に労働集約的個人17の数が多いため実用的ではないです。したがって、平均クラッチのサイズを決定する手法を提案します。
マイクロインジェクション法をここで紹介は、蚊とハエに一貫性のある全身配信を提供します。死亡率と産卵生物検定の追跡と相まって、これらの多目的なツール使用できます小さな RNA 分子、生物学的エージェント、および伝統的な殺虫剤の転写と表現型の影響を評価するために口頭配達が可能ではないです。

蚊、イエバエ科の両方に挑戦する大人コガシラナガゴミムシにアミノ酸、核酸などの小さな分子を提供することを証明されています。不妊 (とき成人の精巣で表されるターゲット遺伝子に排他的) と死亡率 (SNF7 とステロイド受容体コアクチベーターをターゲット) とき幼虫ネッタイシマカを生成する二本鎖 rna の経口摂取量が報告されている1,2.死亡率は、イエバエ幼虫の HSP70 をターゲットにする場合にも観察されている3。このような効果の表現型、ただし、大人ネッタイシマカ Ae。砂糖食事4,5に dsRNA を供給した後結果ないです。
マイクロインジェクションの病原体または全身性反応5,6,7,8,9,10 を誘導することにより、核酸を導入する際に、腸を回避するために使用されています.2.3 低ボリュームの自動配信を可能にするマイクロプロセッサ制御のインジェクターに噴射量の可視化計測を必要とする社内の生産装置に至る機器を含むいくつかのマイクロインジェクション技術が存在する nL5,9,10,11. リボソームの Mrna のターゲット RNA 干渉 (RNAi) トリガーが節足動物牛ティッククリイロコイタマダニ microplusなどの多様な蚊ネッタイシマカとアカイエカの卵巣発育を混乱させるイエバエイエバエ5,9,12,13。これらの研究で、乳酸菌の効果を決定する表現型は終了、または子孫の減少としてマニフェストがあります不可欠であった産卵の停止を監視します。これは、ボルバキア-のような非伝統的な防除方法の多くで重要かつ必要な効果感染男性紹介 (性的互換性がない) し、RNAi による不妊5 は、多世代の致死表現型の形式 ,,914。死亡率と産卵数の両方を追跡特徴と特異性の高い biorationals (自然発生する病原体および/または自然な誘導体)15の開発に必要です。
このプロトコルは、蚊成虫、ハエ; 詳細なマイクロインジェクション技術を提示します。文献にも記述されていないよくするプロセス。また、アダルト コガシラナガゴミムシに dsRNA の及ぼす影響を十分に評価する産卵生物検定の方法論を説明します。これらのプロトコルはネッタイシマカとイエバエ専用として開発されたが、他の種のため変更することができます。

<table><tbody><tr><td>針引っ張り</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>縦型ピペットプー</td><td>ラーKopf</td><td>720</td><td>設定:ヒーター= 15ユニット、ソレノイド= 4アンペアガラス</td></tr><tr><td>キャピラリー、長さ3.5インチ、ID = 0.530 mm &plusmn; 25 &mu;m、OD 1.14 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504949</td><td>Capillaries for pulling glass needles</td></tr><tr><td>Name</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>microinjector station</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter 2010</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメン</td>ツ <td>NANOLITER2010</td><td>マイクロインジェクター</td></tr><tr><td>手動マイクロマニピュレーター</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメン</td>ツ <td>KITE-L</td><td>左手 KITEマニピュレーター</td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>ワールド・プレシジョン・インス</td>ツルメンツ <td>M9</td> ブームスタンドに<td>マイクロマニピュレーター</td></tr><tr><td>精密ステレオズーム双眼顕微鏡</td>を収納 <td>ワールド・プレシジョンズ</td><td>PZMIII-BS</td><td>解剖スコープマイクロインジェクション</td></tr><tr><td>1.5倍対物</td><td>レンズ ワールド精密機器</td><td>顕微鏡</td>ライト<td>用501377対物レンズ</td></tr><tr><td>LEDリング</td><td>ワールドプレシジョンインスツルツ</td><td>504134</td><td>インジェクション用ライトリング 顕微鏡</td></tr><tr><td>実験室用チルテーブル</td><td>BioQuip 製品</td><td>1431</td><td>マイクロインジェクション用チルテーブル</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-1</td><td>注射中の昆虫のステージング</td></tr><tr><td>ローダミンB、98 +%</td><td>Acros Organics</td><td>AC296571000</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>strong会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>蚊の産卵バイオアッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステージング</td><td>スライドプラスチックカップを保持するための</td>大きなペトリ皿<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875714</td></tr><tr><td>- 3 1/2オンス</td><td>ダーツコンテナ株式会社</td><td>TK35</td><td>蚊の産卵バイオアッセイカップ</td></tr><tr><td>マットチュール生地</td><td>ジョアン</td><td>1103068</td>生地産<td>卵バイオアッセイのための</td></tr><tr><td>キャップ</td>は<td>、局所的に取得</td><td></td>血液源、<td>通常はウシまたは生きた鶏1</td></tr><tr><td>x 30mmの透明な食用コラーゲンケーシング</td><td>ブッチャーとパ</td><td>ッカー30D02-05</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーウェイト種子発芽紙</td><td>HEPAフィルター付きアンカーペーパー株式会社</td><td>SD7615L</td><td></td></tr><tr><td>経口吸引器</td><td>ジョン・W・ホック社</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ハウスフライ産卵バイオアッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Lプラスチック食品貯蔵キャニスター</td><td>ウォルマート</td><td>555115143</td><td></td></tr><tr><td>10インチストッキネットスリーブ</td><td>Medonthego.com</td><td></td>、地元で入手したFS15001H<td></td>小麦</tr><tr><td>ふすま</td><td></td>、<td>通常は飼料店で見つける</td>、子牛マナパフォーマンスサプリメント、ValleyVetSupply.com 16731ペレット家畜飼料乾燥卵黄 BulkFoods.com <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>40506</td><td></td></tr><tr><td>黒色の綿布</td>は<td>、</td><td>通常、クラフト用品セクション</td>60 mL カップ Dart Container Corporation P200-N で取得<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

再現可能な dsrna のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

合成鎖 Rna、RNA の干渉を誘発する使用用量依存の表現型効果があります。これらの効果は、非定量的な方法を使用して、二本が配信される場合は、定義が困難です。既知量の核酸または他の化学物質の正確な配信は、テストされている化合物の有効性を測定して化合物間の信頼性の比較を許可するように重要です。
ここで通常注入損傷による死亡を減少して dsRNA の特定の線量の正確な配信を保証する再現性のある、定量的マイクロインジェクション プロトコルを提供します。これらの変更は、ローダミン B、卒業注射針の追加を含むし、Isoe とコリンズから改善回復法を借りた。この方法の線量応答の計算および化合物間の比較が容易になります。このメソッドのバージョンは、リボソーム RNA 転写のサイレンシングに起因する多産の削減を評価する蚊とハエの 3 属に正常に使用されています。
このプロトコルは、小さな昆虫マイクロインジェクションのいくつかの課題を軽減するための戦略を提供します。一緒に、機械視覚的検証を伴う二本鎖 rna の配信、配信、効果的な場所の同定と投与後の回復期間を含めることは、正確な投与と低傷害死亡を確認します。このプロトコルには、産卵に及ぼす影響の制服を決定するため産卵生物検定もについて説明します。

蚊の dsRNA のマイクロインジェクション
この微量注入法は、いくつかの蚊属 (ヤブカ属、ハマダラカ、アカイエカ) の間で遺伝子発現、死亡率および 80 以上の dsRNA のトリガーの産卵応答を評価する私たちの研究室で使用されています。リボソームのトラン スクリプト RPS6 と RPL26 (Estepらを参照から派生した dsRNA の 1 μ g とAe。 ネッタイシマカ(ORL1952) のコロニーのひずみから女性を注入dsRNA の製造方法およびシーケンス データの5 ) を示した重要な相対表現 (RE) は複数の産卵の減少サイクル制御 dsGFP を注入する蚊と比較した場合。ネッタイシマカ次の 2nd生殖サイクル測定日時 RPS6 式の大幅な削減を示した (P 0.05 &lt;) 同じグループ (図 4)5 の dsGFP コントロールの間学生の t テストにより決定される、dsRPS6 を注入する蚊.
産卵数は、ここで説明した産卵バイオアッセイを使って個々 の女性から評価されました。3 日後投与蚊は血液供給、個々 産卵容器に転送され完了するレイアウトすることをあった。両方の dsRPS6 処理Ae ネッタイシマカの最初の生殖サイクルの平均クラッチのサイズが大幅に削減 (n = 102 人の女性、1.3 ± 0.8 (平均 ± SE) 卵) と扱われる dsRPL26 (n = 86 人の女性、4.0 ± 1.1 卵) dsGFP 注射と比較されたとき (n = 79。女性、49.3 ± 3.5 卵、図 5 a)。2 番目の生殖サイクル後のクラッチの評価はまた大幅に削減産卵両方の dsRNA 扱われるグループが削減効果の大きさを示した。Ae。 ネッタイシマカのグループ サイズ変数、従って手段分離はダンのテスト5によって行われました。20 4 時間の死亡率は 3% で通常以下。
50 に 1 μ g から dsRPS6 を注入すると、明確な線量効果が観察された (図 5 b) 25 ng/女性 dsRPS6 線量以外はすべて 1 μ g/女性 dsGFP 注入コントロールと比較して ng の女性Ae。 ネッタイシマカ、とクラッチ ・ サイズが大幅に変化。
DsRNA の家のハエします。
コロニーイエバエ(通常 ORL) は、イエバエ RPS6 と RPL26 の成績9に対して設計された dsRNA 構造の 5 μ g を注入しました。Ae。 ネッタイシマカにみられたように両方の特定のコピー式 (RPS6 と RPL26) の大幅な削減やクラッチ サイズの減少 (図 4 および図 5 a) に観察されました。RE の大幅な削減は、同じグループの dsGFP コントロールの間学生の t テストによって決定された (P 0.05 &lt;) ホルム Sidak テストが異なるm. イエバエのクラッチ サイズの意義を決定に使用されたと治療群。卵巣の解剖は、ハエを供給 dsGFP ティンダル ビスコーにあるスケール9評価通常ビテロジェニン蒸着中 dsRPS6 と dsRPL26 の治療で減らされた卵の形成を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig1.jpg"> 図 1: 蚊成虫、ハエに microvolumes を配信するマイクロインジェクション セットアップします。注射は冷麻酔昆虫冷たいテーブルに顕微鏡のスライド開催され実行されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig2.jpg"> 図 2: Ae。 ネッタイシマカとイエバエのマイクロインジェクション サイト。(A)大人ネッタイシマカ Ae。が、mesokatepisternum の中央 3 分の 1 に注入されます。(B)大人m. イエバエmesopleuron で注入されます。矢印は、注入部位を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig3.jpg"> 図 3: 産卵バイオアッセイ セットアップ。(A) Ae。 ネッタイシマカ産卵アッセイは産卵基質、チュールと 10% のショ糖に浸した綿を上限として種子発芽の紙カップ。(B)成人女性m. イエバエ産卵試験容器に食品 (A)、水 (B) と (C) 幼虫メディア。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig4.jpg"> 図 4: Ae。 ネッタイシマカと種特異的な二本を注入したイエバエRPS6 の相対式。ネッタイシマカとイエバエのいずれかのコントロールの dsRNA (dsGFP) のそれぞれ 1 および 5 μ g を注入したまたは dsRNA 設計 RPS6 または RPL26 に対して各昆虫の成績証明書。大幅な削減 (P 0.05 &lt;) の dsRPL26 (アスタリスクによって示されます) を注入したハエで蚊とハエ dsRPS6 と注入 RPS6 の発現がみられました。誤差範囲を表す平均 ± SE、柱脚の数が, 個体数を示します。この図は、Estepらから変更されています。5と Sanscrainteら9.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58650/58650fig5.jpg"> 図 5: 平均クラッチ サイズAe。 ネッタイシマカとイエバエ種特異的な二本を注入します。(A)産卵を有意に減少した (P 0.05 &lt;) Ae。 ネッタイシマカのいずれかのコントロールのそれぞれ 1 および 5 μ g の注射後m. イエバエdsRNA (dsGFP) または dsRNA は各昆虫から RPS6 または RPL26 トラン スクリプトに対して設計。アスタリスクは、同じグループの dsGFP コントロールから有意な差を示しています。誤差範囲を表す平均 ± SE、柱脚の数が, 個体数を示します。この図は、Estepらから変更されています。5と Sanscrainteら9. Ae。 ネッタイシマカ1000 ng/女性 50 ng/女性から dsRPS6 を注入の(B)線量曲線注入 dsGFP コホートに比べて産卵数の大幅な削減を示しています (50、100、1000 ng/女性)。誤差範囲は、線量あたり 36 81 個体から平均 ± 95% 信頼区間を表します。文字のポイントを表すグループ間に有意差 (P 0.05 &lt;) 分散分析によって識別されます。この図は、Estepらから変更されています。5.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58650/58650fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルでは、標準化し、蚊とハエの体液に直接核酸の特定の量を提供する数年間使用したマイクロインジェクションの方法論について説明します。このプロトコルは、最小限の注入の死亡率の結果し、多産の相関の線量測定が可能します。

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

この方法は、二本鎖RNAが遺伝子発現に与える影響や、成体ジプテランの胎児性など、バイオ農薬分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、二本鎖RNAの定量可能な用量が蚊またはフライに送達され、その結果、多世代の致死性に影響を与える可能性がある点である。この方法は、蚊、アエデスアエジプティ、ハウスフライ、ムスカドミナのために提示されていますが、それはまた、蚊やハエの他の種に適用することができます。一般的に, この方法に新しい個人は苦労します, 注射手順自体を習得することは時間投資であるため、.各昆虫に最適な針先のサイズを注入することは、傷害および死亡率を最小限に抑えながら、確実に送達するために重要である。まず、鉗子を使用して慎重に蚊をステージングし、最終的に顕微鏡スライドに約半センチメートル離れて露出させます。スライドの取り扱いを補助するには、スライドの左端または右端に 1 センチのスペースを 1 つ残します。その後、大きなシャーレで摂氏4度で上演された昆虫のスライドを置きます。冷たいテーブルの上に解剖顕微鏡およびマイクロインジェクターを設置しなさい。ガラスの毛細血管を細かい先端に引っ張った後、毛細血管針をマイクロインジェクターに入れ、針の先端を鉗子で割ります。その後、ヌクレアーゼを3回引き上げて排出して針をすすきます。ガラス針の開口部の大きさは、蚊とハエによって異なります。次に、蚊に対して適切な濃度の注射液を調製する。ビジュアライゼーションを助けるために溶液にローダミンBのミリリットルあたり3マイクログラムを加えます。ピペットを使用して3~4マイクロリットルの溶液をきれいな表面に移し、空気を取り込まずにガラスの針に引き込みます。液体が針から分配し始めるまで、注入ボタンを繰り返し押します。液体半月板から針のシャンクまで、約1ミリメートル離れたハッシュマークを描くために超微細なポイントマーカーを使用してください。針の下に蚊のスライドを設定し、針の中の溶液半月板を見るのに十分な視野が広いようにします。針を中胸骨の真ん中1/3に合わせます。蚊の反対側に鉗子を置いて針に蚊を支え、針の先端でキューティクルをそっと穿刺します。先端が正中線を通過するまで、針を蚊にそっと滑り込まします。必要な量の液体が注入されるまで、注入ボタンを押し下げます。半月板が動かない場合は、ゆっくりと蚊を滑らせるか、半月板の動きを見ながら針から飛び降りる。注射液の一部が針の除去時にキューティクルからビーズを出した場合、または半月板が動かない場合は、注射が成功しなかったので昆虫を捨てる。家の飛行中に、メソプロロンに針を合わせます。ハエの反対側に鉗子を置いて針にハエを向け、針の先端でキューティクルをそっと穿刺します。注入された昆虫を10〜15のグループで3.5オンス保持カップをクリアします。その後、網でカップをカバーし、室温で回復することができます。昆虫が回復した後、10%スクロース溶液に浸した綿のボールの上に保持カップを反転させます。まず、12インチの人工膜に新鮮な血液を充填し、温水浴で摂氏60度に加熱します。ペーパータオルで膜を乾かし、保持カップの網掛けキャップを横切って置きます。蚊が餌を与えた後、綿のボールを交換し、蚊が24時間休むことを許可します。次に、透明な3.5オンスのバイオアセテートカップに約30ミリメートルの脱イオン水を充填して、オビジポジションカップを構築します。その後、カップの底に種子の発芽紙を置きます。カップを網で覆い、ネットキャップに小さなスリットをカットします。給餌の24時間後、ホールディングカップのキャップに小さなスリットをカットし、正常に供給された女性をオビポジションカップに移します。その後、10%スクロース飽和コットンボールで卵位キャップに小さなスリットを密封します。蚊を監視し、毎日の死亡率を追跡します。蚊に5〜7日間オビポジットを許可した後、解剖顕微鏡の下で卵を数えます。この手順のデモンストレーションは、USDA ARS研究昆虫学者のクリストファー・ゲデン博士です。注射の3日後、ハエを二酸化炭素で麻酔する。その後、水と準備フライダイエットときれいなケージにハエを転送します。死亡率データを記録し、毎日死んだハエを取り除く。次に、75%の小麦ふすまと25%ペレットの生きたストック飼料を重量で混ぜ、幼虫飼育培地を調製する。62%の水分が得られるまで混合物に水を加えます。湿らせた小麦ふすまの生き物飼料混合物を黒い布の正方形に加え、ボールに転がします。ゴムバンドを使用して布を所定の位置に保ち、液体媒体が浸透するまで穏やかに絞ります。ボールを60ミリリットルのカップに入れ、フライケージに5時間置きます。この後、卵をボールからすすいで、卵が布のひだの下から取り除かれます。任意のクラスターを破壊するために卵を振り、卒業した20ミリリットル遠心管にそれらを転送します。卵が落ち着くことを許可し、チューブ内の落ち着いた卵の量に注意してください。その後、十分な水を加え、その体積を、落ち着いた卵の20倍の体積にします。次に、磁気攪拌棒を使用して、水と卵懸濁液を混合します。最後に、変更されたピペットチップを使用して、一連のラインでプレ湿らせた黒い布の一部にサスペンションの0.5ミリリットルを分配します。このプロトコルでは、雌の蚊を遺伝子発現を評価するためにマイクロインジェクションした。二重鎖RNAを女性に注入することは、複数のオビ位置サイクルにわたる相対的発現の有意な減少を示した。最初のゴトロフィックサイクルにおける蚊の平均クラッチサイズは、dsRPS6およびdsRPL26の両方で治療されたグループで有意に減少した。メスの蚊に1マイクログラムから50ナノグラムまでdsRPS6を注入する際に、クラッチサイズで明らかな用量効果が観察された。ハウスハエには、5マイクログラムの二重鎖RNA構築物も注入された。蚊の観察と同様に、特定の転写産物発現およびクラッチサイズの両方の有意な減少が指摘された。この手順を試みる間、正常に注入されなかった昆虫を捨てることを忘れないでください。この手順を使用すると、任意の二重鎖RNA構造または他の生体理性を蚊またはハエに送達することができる。ガラスの針で作業することは危険であり、適切なシャープ廃棄物容器に常に処分する必要があることを忘れないでください。

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JoVE Journal

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環境

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再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

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