再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

このプロトコルでは、標準化し、蚊とハエの体液に直接核酸の特定の量を提供する数年間使用したマイクロインジェクションの方法論について説明します。このプロトコルは、最小限の注入の死亡率の結果し、多産の相関の線量測定が可能します。

この方法は、二本鎖RNAが遺伝子発現に与える影響や、成体ジプテランの胎児性など、バイオ農薬分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、二本鎖RNAの定量可能な用量が蚊またはフライに送達され、その結果、多世代の致死性に影響を与える可能性がある点である。この方法は、蚊、アエデスアエジプティ、ハウスフライ、ムスカドミナのために提示されていますが、それはまた、蚊やハエの他の種に適用することができます。

一般的に, この方法に新しい個人は苦労します, 注射手順自体を習得することは時間投資であるため、.各昆虫に最適な針先のサイズを注入することは、傷害および死亡率を最小限に抑えながら、確実に送達するために重要である。まず、鉗子を使用して慎重に蚊をステージングし、最終的に顕微鏡スライドに約半センチメートル離れて露出させます。

スライドの取り扱いを補助するには、スライドの左端または右端に 1 センチのスペースを 1 つ残します。その後、大きなシャーレで摂氏4度で上演された昆虫のスライドを置きます。冷たいテーブルの上に解剖顕微鏡およびマイクロインジェクターを設置しなさい。

ガラスの毛細血管を細かい先端に引っ張った後、毛細血管針をマイクロインジェクターに入れ、針の先端を鉗子で割ります。その後、ヌクレアーゼを3回引き上げて排出して針をすすきます。ガラス針の開口部の大きさは、蚊とハエによって異なります。

次に、蚊に対して適切な濃度の注射液を調製する。ビジュアライゼーションを助けるために溶液にローダミンBのミリリットルあたり3マイクログラムを加えます。ピペットを使用して3~4マイクロリットルの溶液をきれいな表面に移し、空気を取り込まずにガラスの針に引き込みます。

液体が針から分配し始めるまで、注入ボタンを繰り返し押します。液体半月板から針のシャンクまで、約1ミリメートル離れたハッシュマークを描くために超微細なポイントマーカーを使用してください。針の下に蚊のスライドを設定し、針の中の溶液半月板を見るのに十分な視野が広いようにします。

針を中胸骨の真ん中1/3に合わせます。蚊の反対側に鉗子を置いて針に蚊を支え、針の先端でキューティクルをそっと穿刺します。先端が正中線を通過するまで、針を蚊にそっと滑り込まします。

必要な量の液体が注入されるまで、注入ボタンを押し下げます。半月板が動かない場合は、ゆっくりと蚊を滑らせるか、半月板の動きを見ながら針から飛び降りる。注射液の一部が針の除去時にキューティクルからビーズを出した場合、または半月板が動かない場合は、注射が成功しなかったので昆虫を捨てる。

家の飛行中に、メソプロロンに針を合わせます。ハエの反対側に鉗子を置いて針にハエを向け、針の先端でキューティクルをそっと穿刺します。注入された昆虫を10〜15のグループで3.5オンス保持カップをクリアします。

その後、網でカップをカバーし、室温で回復することができます。昆虫が回復した後、10%スクロース溶液に浸した綿のボールの上に保持カップを反転させます。まず、12インチの人工膜に新鮮な血液を充填し、温水浴で摂氏60度に加熱します。

ペーパータオルで膜を乾かし、保持カップの網掛けキャップを横切って置きます。蚊が餌を与えた後、綿のボールを交換し、蚊が24時間休むことを許可します。次に、透明な3.5オンスのバイオアセテートカップに約30ミリメートルの脱イオン水を充填して、オビジポジションカップを構築します。

その後、カップの底に種子の発芽紙を置きます。カップを網で覆い、ネットキャップに小さなスリットをカットします。給餌の24時間後、ホールディングカップのキャップに小さなスリットをカットし、正常に供給された女性をオビポジションカップに移します。

その後、10%スクロース飽和コットンボールで卵位キャップに小さなスリットを密封します。蚊を監視し、毎日の死亡率を追跡します。蚊に5〜7日間オビポジットを許可した後、解剖顕微鏡の下で卵を数えます。

この手順のデモンストレーションは、USDA ARS研究昆虫学者のクリストファー・ゲデン博士です。注射の3日後、ハエを二酸化炭素で麻酔する。その後、水と準備フライダイエットときれいなケージにハエを転送します。

死亡率データを記録し、毎日死んだハエを取り除く。次に、75%の小麦ふすまと25%ペレットの生きたストック飼料を重量で混ぜ、幼虫飼育培地を調製する。62%の水分が得られるまで混合物に水を加えます。

湿らせた小麦ふすまの生き物飼料混合物を黒い布の正方形に加え、ボールに転がします。ゴムバンドを使用して布を所定の位置に保ち、液体媒体が浸透するまで穏やかに絞ります。ボールを60ミリリットルのカップに入れ、フライケージに5時間置きます。

この後、卵をボールからすすいで、卵が布のひだの下から取り除かれます。任意のクラスターを破壊するために卵を振り、卒業した20ミリリットル遠心管にそれらを転送します。卵が落ち着くことを許可し、チューブ内の落ち着いた卵の量に注意してください。

その後、十分な水を加え、その体積を、落ち着いた卵の20倍の体積にします。次に、磁気攪拌棒を使用して、水と卵懸濁液を混合します。最後に、変更されたピペットチップを使用して、一連のラインでプレ湿らせた黒い布の一部にサスペンションの0.5ミリリットルを分配します。

このプロトコルでは、雌の蚊を遺伝子発現を評価するためにマイクロインジェクションした。二重鎖RNAを女性に注入することは、複数のオビ位置サイクルにわたる相対的発現の有意な減少を示した。最初のゴトロフィックサイクルにおける蚊の平均クラッチサイズは、dsRPS6およびdsRPL26の両方で治療されたグループで有意に減少した。

メスの蚊に1マイクログラムから50ナノグラムまでdsRPS6を注入する際に、クラッチサイズで明らかな用量効果が観察された。ハウスハエには、5マイクログラムの二重鎖RNA構築物も注入された。蚊の観察と同様に、特定の転写産物発現およびクラッチサイズの両方の有意な減少が指摘された。

この手順を試みる間、正常に注入されなかった昆虫を捨てることを忘れないでください。この手順を使用すると、任意の二重鎖RNA構造または他の生体理性を蚊またはハエに送達することができる。ガラスの針で作業することは危険であり、適切なシャープ廃棄物容器に常に処分する必要があることを忘れないでください。