処理と人間プライマリ前立腺培養の評価

ここでは、人間プライマリ前立腺における処理をガイドし、表現型を評価するためにエンドポイントを提案するプロトコルを提案する.播種、文化の維持、マトリックス ゲルからの回復形態の定量化、埋め込み断面、FFPE 切片、全取り付ける染色と商業アッセイの適用を示します。

前立腺オルガノイドは、発達と病気を研究するためのエキサイティングなインビトロシステムです。彼らは不死化細胞株の課題を克服し、動物モデルに代わる安価な代替手段を提供します。彼らは、このプロトコルで示したように、ヒト前立腺細胞とマウス前立腺細胞から、疾患関連の前臨床モデルシステムとして成長させることができる。

多くのラボでは、有用なカルチャの方法とエンドポイントについて説明しています。しかし、これらの詳細を1つのプロトコルにまとめ、新しいユーザーにとって特に困難なステップを実証したいと考えています。技術が向上するにつれて、前立腺癌オルガノイドは、疾患をモデル化し、治療への応答をモデル化するための精密医療アプローチとして患者のサンプルから成長させることができる。

培養条件は前立腺オルガノイドに特異的であるが、エンドポイントの多くは他の組織タイプから適応されている。ユーザーは、このプロトコルの一部をセルの種類に合わせて調整できます。原稿に記載されているように、マトリックスゲルコード96ウェルプレートで上皮細胞を成長させることによって、この実験を開始します。

12日後にプレートからオルガノイドを採取するには、マトリックスゲルを乱すことなく井戸から培地を取り除きます。その後、すぐに約200マイクロリットルの中性プロテアーゼを各ウェルに加え、マトリックスゲルと中性プロテアーゼの約1対2の比率で添加します。プレートを摂氏37度で20分間インキュベートします。

その後、ピペットを上下にして機械的に解体し、摂氏37度で20分間再びインキュベートします。インキュベーション後、中性プロテアーゼマトリックスゲル細胞混合物を数ウェルからマイクロ遠心チューブに移します。300回gで300回の遠心分離により細胞を3〜5分間ペレットする。

上清を除去し、その後の分析のためにオルガノイドペレットを保存します。埋め込み用の金型を作成するには、1,000マイクロリットルのピペットチップの小さな部分を切り取り、50マイクロリットルを保持するシリンダーを作ります。次に、同じ先端の広い部分から、最初の金型の周りに収まる2番目の広い金型を作ります。

コールドブロックを作成するには、接着剤の側面を上にしてテープでアイスパックを包みます。次に、金型をテープに垂直に貼り付けます。処理用の組織学のゲルプラグにオルガノイドを埋め込むには、まず、ハンクのバランス塩溶液の1ミリリットルで以前に得られたオルガノイドペレットを洗浄します。

300回gで3〜5分間遠心した後、上清を取り除きます。その後、オルガノイドペレットに30〜50マイクロリットルの液体組織学ゲルを加え、ゆっくりと上下にピペットしてペレットを再中断して穏やかに混ぜます。この混合物をコールドブロックの金型に移し、試料を冷却してプラグに固めます。

次に、プランジャーを使用して、小さな金型から大きな金型の中心にプラグを押し出し、プラグの周りに2%寒天を透明にピペットで充填します。サンプルの上部をマークするには、ピペット組織染色色2%寒天をプラグの上に着色します。寒天が冷却されたら、プランジャーを使用してプラグを占体カセットに移します。

カセットに鉛筆のラベルを付け、一晩固定するために10%中性緩衝ホルマリンに入れます。翌日、カセットを10%中性緩衝ホルマリンから70%組織グレードのエタノールに移し、さらにパラフィンに埋め込んで処理する。まず、ブロックの底面を10マイクロメートルの厚さでトリミングします。

プラグ領域を含むセクションが表示されたら、トリミングを停止します。ミクロトームローターをロックし、氷の上にブロックを戻して冷やします。ブレードを未使用の新しい部分に移動します。

そして、ブロックをクランプに戻します。機械のロックを解除し、セクションあたり5マイクロメートルでトリミングを開始します。ピンセットを使用して、セクションを摂氏40度の水浴に移し、広げます。

スライドを水に垂直に浸してセクションをその上に移します。次に、明視野顕微鏡下でスライドを観察し、オルガノイドがセクションに存在することを確認します。摂氏45~50度で一晩焼き、原稿に記載されているように染色を進めます。

96ウェルマトリックスゲルコーティングプレートの未使用のウェルとオルガノイドを使用して、実験のこの部分を開始します。ウェルの側面にピペットを入れることで、培地とマトリックスゲルの間に空間を残し、オルガノイド培養を中断することなくできるだけ多くの培地を慎重に除去する。トリミングされた1,000マイクロリットルのピペットチップを使用し、PBSでプリウェットして、目的のオルガノイドを含むマトリックスゲルの1滴を作成します。

チャンバースライドの真ん中にドロップを分配します。肉眼で、細かいチップピペットを使用してチャンバースライドから余分な培地およびマトリックスゲルを吸引する。ガラスへのオルガノイド付着を促進し、その後の洗浄工程中にサンプルの損失を防ぐために。

37°Cインキュベーターに30〜45分間スライドを置きます。皿からの剥離を防ぐためにゆっくりとピペットを作り、1X PBSの200マイクロリットルを加え、オルガノイドを穏やかな揺れで室温で5分間洗浄します。慎重に1X PBSを取り除き、4%パラホルムアルデヒドの200マイクロリットルを追加します。

穏やかな揺れで室温で30分間固定します。PFAでは、このプロトコルで説明されているように、洗浄し、その後のパーメアビライゼーションと染色手順を進めます。マウントとイメージはすぐに。

染色されていない切断スライドは、ヒトの一次前立腺オルガノイドをはっきりと示していますが、染色されていないドライスライドでは、オルガノイドは半透明に見え、明視野顕微鏡下で検出するのが難しくなります。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、アグレッシブなピペットニング、適切に処理されたオルガノイドと比較して間違った処理プロトコルなどの誤った取り扱いによる壊れたヒト一次前立腺オルガノイドを示す。ヒト一次前立腺オルガノイドをホルマリン固定、パラフィン埋め込み、切り離し、基底シトケラチン5とルミナルサイトケラチン8で染色し、基底p63および発光サイトケラチン8、共焦点顕微鏡で画像化した。

全身に取り付けられたヒト初立前立腺オルガノイドを、基底シトケラチン5または発光サイトケラチン8で染色し、タロイジンおよびDAPIで対数化し、共焦点顕微鏡で画像化した。全身に取り付けられたヒト初代前立腺細胞オルガノイドを蛍光標識されたエドゥで染色し、Hoeschtでカウンター染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。手順を通してオルガノイドを視覚化することが重要です。

セクションを収集した後、スライド上のサンプルを視覚化し、オルガノイドを全体取り付け中に観察することを確認してください。マトリックスゲルからオルガノイドを収集した後、それらを完全にマウントして市販のアッセイを使用したり、フローサイトメトリーまたは単一細胞シーケンシングのために単一細胞に解離することができます。3D培養は、ラボディッシュの設定で組織を研究する新しい方法を研究者に提供します。

それは、器官形成に適用することができ、または患者の疾患の病理を理解するために。患者のサンプルを扱う場合は、常に注意を払い、血液媒介病原体暴露の可能性として材料を処理してください。