インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

ここでは、一次線維芽細胞を用いてインビトロスクラッチアッセイを行い、マウスにおける生体内皮膚創傷治癒アッセイに関するプロトコルを提示する。両方のアッセイは、インビトロおよびインビボ創傷治癒を評価するための簡単な方法です。

皮膚創傷の治療のための反乱軍の必要性。薬物治療のためのあなたのターゲット分子を同定するために、インビトロおよびインビボ試験システムが必要である。適切なシステムは、インビトロスクラッチアッセイ、およびインビボの下振れ皮膚折りチャンバーである。

いずれも、薬理学的に活性な化合物の存在および存在下において、細胞遊動および皮膚創傷治癒をモニタリングするためのまっすぐ進んだ処置である。どちらの方法も簡単ですが、調査員はスクラッチアプリケーションを実践する必要があります。そして、後方皮膚折りチャンバーの移植、および創傷は、信頼性と再現性のある結果を得るために。

この手順のデモンストレーションは、臨床および実験外科研究所の外科医で教授のマティアス・ラッシュケ博士によって行われます。手順を開始する前に、各培養物のスクラッチ領域を線分にするために、各ウェルの下部に水平線を使用して、セルタイプごとに1つの6つのウェルプレートをマークするために超微細な永久マーカーを使用してください。次のプレートは、野生型およびβ3欠損マウスから単離された一次繊維ブラストを、5倍の10倍の5倍の5倍の繊維濃度で6つのウェルプレートで、十分濃度当たりの5番目の繊維ブラストを行う。

DMEMの2mLで10%のウシ胎児血清を補充した。プレートにセルタイプ、遺伝子型、日付のラベルを付けます。そして、24時間培養インキュベーターにプレートを入れます。

翌朝、目的とする各脂質ベースのトランスフェクション試薬の9マイクロリットルを加え、チューブあたり150マイクロの減少した血清培地を含む個々のマイクロ遠心管に添加する。150マイクロリットルの減らされた血清培地を含むトランスフェクション試薬ごとに、2マイクロ遠心分離チューブに1.5マイクロリットルのsiRNAを加えます。そして、各siRNA溶液をトランスフェクション試薬溶液の単一のチューブと混合します。

短時間渦を打った後、混合物を摂氏21度で5分間置きます。インキュベーション中は、各ウェルのスーパーネートを慎重に交換してください。2.25mLの新鮮な培養培地を井戸の側面に下ろして。

インキュベーションの終わりに、適切なsiRNAトランスフェクション試薬混合物の250マイクロリットルを加え、対応する各ウェルの細胞に賢明にドロップする。そして、72時間細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。細胞が100%合流した場合は、各ウェルから培養上清を捨てます。

また、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、コンフルエントセル単層にスクラッチを作成します。各ウェルの下部にマークされた水平線に垂直。その後、1回の洗浄につき2mLのPPSで、負傷した各々を2回慎重に洗い流します。

損傷した細胞、緩い細胞または傷ついた領域からの破片から放出された因子を除去する。2回目の洗浄後、各ウェルに1または10%の血清を添加した2mLの新鮮な細胞培養培地を加える。そして、光顕微鏡のステージ上の各プレートの創傷の画像をキャプチャします。

10倍の倍率で引っ掻いた直後。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに戻す。次の30時間の間、適切な実験時間で画像をキャプチャし続けます。

実験終了時に、培養6時間、10時間及び30時間後の初期細胞フリー領域及び残存領域を定量する。初期スクラッチ領域に対する移行セルによって再設定されたスクラッチ領域の割合を決定します。足の指ピンチへの応答の欠如を確認した後、野生のタイプまたはベータ3ノックアウトC57ブラック6マウスで、慎重にドーサムを剃ります。

そして、動物の目に軟膏を適用します。脱毛クリームを適用して、残りの髪を排除します。10分後にクリームを取り除く。

チタンチャンバーを準備するには、対称的なチタンチャンバーフレームの一部をナットで接続ネジで固定します。チャンバーの2つの対称部分の間に400〜500マイクロメートルを維持する。皮膚の血液小胞の圧迫を避けるために。

70%エタノールで露出した皮膚を消毒する。そして、光源の前で皮膚の折り目をつかみます。皮膚の二重層の中間線を、チタンチャンバーが埋め込まれる場所に配置します。

そして、歯ごたえとキャドリーポリプロピレン縫合糸で皮膚折り目を固定します。金属ラックの縫合線の反対側を締め、折りたたんだ皮膚を持ち上げます。そして、マウスが快適に座ることができるようにラックの高さを調整します。

チタン室の第1フレームを、その上にポリプロピレン縫合糸を裏面の裏面に縫合して背部皮膚フォールドの裏面に縫合する。沈下を再確認した後、皮膚に小さな切開を行うために細かいはさみを使用してください。そして、チタンチャンバーの前半に取り付けられた2本の接続ネジを、皮折りのベースを通して渡します。

ラックからマウスを取り外し、動物を横方向の位置に置きます。3つの接続ねじの上にチタンチャンバーの2番目の無料の半分を置きます。そして手動でチタンフレームの後半を通してこれらのネジを渡すためにわずかな圧力を適用します。

折り畳まれた皮膚層は、チタンフレームの2つの対称的な半分の間に挟まれています。その後、ステンレス鋼ナットで両方の対称部品を固定します。標準化された直径2mLの生検パンチを使用して、皮膚の中央に創傷領域をマークし、皮膚折りたたみチャンバーの観察窓内で。

そして、細かい鉗子とはさみを使用して、マーク内の表皮と真皮全体を取り除きます。円形の巻を作成します。0.5mLの滅菌生理液で3.5mLの2乗の創傷を3.5m以上に洗浄します。

そして、ガラスのカバースリップで傷口を覆います。チタンチャンバーのスナップリングペンチを使用して、カバースリップを所定の位置に固定します。そして、すぐに実体顕微鏡の撮像段階にマウスを移す。

その後、40倍の倍率で傷を画像化します。完全な回復まで監視とケージにマウスを置く前に。200マイクロリットルのピペットチップを使用してスクラッチを作成した後、この代表的な実験では、両方の遺伝子型の細胞がスクラッチ領域に移行し、ギャップを閉じました。

次に、細胞移動を、スクラッチを行ってから6時間後に細胞を移行させることにより、スクラッチ領域の再取り込みの割合として定量した。例えばこの実験では、Cav beta3欠損した繊維ブラストを移行し、野生型マウスからの繊維ブラストよりも大幅に早くスクラッチ領域を閉じた。Cav β3欠損型繊維爆風で観察されたCav β3依存効果を確認するために、野生型繊維ブラストをsiRNAにトランスフェクトし、Cav β3タンパク質をダウン調節した。

Cav β3特異的なsiRNAで処理された繊維ブラストは、β3欠損繊維ブラストのように振る舞った。両遺伝子型間の皮膚創傷治癒を比較するために、皮膚折り畳みチャンバーの創傷領域を創傷直後に撮影した。そして、創傷は次の2週間にわたって画像化された。

創傷の大きさは、画像および創傷領域で測定され、所定の日に、初期創傷領域の割合として表した。予想通り、野生型制御と比較してCav β3欠損マウスにおいて創傷閉鎖率が増加した。各スクラッチのために、ピペットチップに等しい圧力を加え、できるだけプレート底部のマークされた線に傷を一致させます。

下方皮膚折りチャンバーの観察窓は、治癒プロセス中にいつでも開くことができます。異なる薬理学的に活性な化合物の局所適用を可能にする。また、治癒過程の異なる段階で傷ついた領域を切除することも可能である。

分子タンパク質生化学または組織学的分析のため。