皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

形態学的変化は、活性化後の免疫応答性線維芽細胞で起こり、細胞募集の変化を促進する。遺伝子組み換え線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)-creと組み合わせて2光子イメージングを利用する。tdTomatoフロキセドストップフロキ^{シング(TB/TB)}マウスラインと緑色蛍光タグ付きリポ多糖-FITCは、真皮線維芽細胞におけるリポ多糖類の非常に特異的な取り込みおよび生体内の形態変化を示すことができる。

私たちのプロトコルは、蛍光タグ付き細胞が生きている動物の炎症性末梢刺激にどのように反応するかをリアルタイムで視覚化することを可能にします。2-光子イメージングは、生きた標本の組織に深く可視化することを可能にし、細胞の完全性と微小環境を維持し、生物学的システムの正確な表現を提供する。呼吸は時間の経過とともに足を動かし、ぼやけたり焦点面を失う原因となる。

画像を撮る前に、必ずテープでしっかりと足を固定してください。この中で、あなたは興味のある適切な平面を見つけることができる必要があり、その目的が触れることなく足に近く、注射部位の真上にあることを確認してください。手順を開始する前に、マルチフォトンシステムをオンにして、25Xの主観を選択します。

立体多光子顕微鏡のステージに立体型装置を設置し、その装置を麻酔用デリバリー機に接続します。マウスの足の接続点として、装置の表面にマットブラックペーパーを置きます。512 x 512 マイクロメートルの固定スキャン領域で共振スキャナを設定します。

930 および 1,100 ナノメートルの励起波長にそれぞれ緑と赤色の蛍光タンパク質信号の励起レーザーを調整します。690~1,050ナノメートルの二色光ミラーを使用して、両方の励起レーザーの光路を単一の目的に向け、930ナノメートル調整された励起レーザーをメインスキャナに反映させ、1,100ナノメートルレーザーをメインスキャナに直接通過させます。FITCのレーザーパワーを5%、緑色蛍光タンパク質を20%に設定し、オーバーヘッドライトを消します。

in vivoイメージングの場合、マウスを麻酔し、テキストプロトコルで概説します。麻酔マウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認し、鼻コーンへのアクセスを持つステレオタックス装置にマウスを置きます。黒いテープを使用して、後ろ足を関心領域に近い領域と遠位の両方の領域に黒い紙にしっかりと貼り付け、足の足底面が妨げられていないことを確認し、目的に向かって向き合います。

水に基づいた潤滑剤を足の足底面にたっぷり入れます。潤滑油に対する目的をタッチして、足と目的の間に液体の列を作成します。FITC励起光を使用して足の真皮層に焦点を合わせ、タンデムダイマートマトタグ付き線維芽細胞を視覚化できることを確認します。

両方のレーザーで後足の足底面のすぐ下にある細胞の領域を画像化します。1スライスあたり約1マイクロメートルで約5~10 Zの15分間の時間経過を取得し、環境のベースライン表現を確立します。ベースラインイメージングが得られたら、25マイクロリットルガラスのハミルトンシリンジに、PBSの20マイクロリットルあたりFITCコンジュゲートリポ多糖(LPS)の5マイクログラムをロードします。

足の位置を乱すことなく、実験後足に足底内注射を行うことで溶液を投与する。その後、両方のレーザーで後足の足底面のすぐ下にある細胞の領域を画像化します。LPS FITCの細胞媒介性板内取り込みについて、約1マイクロメートルで約5~10Zスライスの60~120分のタイムラプスを獲得します。

真皮層内の細胞によって固有の蛍光が存在しないので、後足の真皮層内の無数の細胞が野生型マウスでの板腔内注射後に蛍光タグ付きLPSを服用して観察することができる。LPS FITC注射後、受容体4のように通行料を発現する線維芽細胞の線維芽細胞の線維芽細胞は、これらの細胞によって発現されるタンデムダイマートマトタグと共局在化して高レベルの共局在化を行う線維芽細胞特異的タンパク質1個のみである。対照的に、受容体4のような通行料を持つマウスは、注射後にLPSに結合して取り込む。

実際、LPS FITC注射後に細胞のシルエットが見えるのは、薬物が細胞の周りの間質液中に分散していることを示しているが、実際には受容体によって結合されていない。このプロトコルで覚えておくべきことは、動きや呼吸によるビデオの歪みがないように足が固定されていることを確認することです。この手順を使用して、傷害後の領域への蛍光タグ付き細胞の募集と、時間の経過に伴う刺激に対する細胞の応答の形態学的変化を追跡することができる。

したがって、2-Photonイメージングは、研究者が注射後に生きている動物で何が起こるかを評価するために、遺伝的レポーターマウスと蛍光タグ付けされた化合物を組み合わせることを可能にします。