狂犬病診断のためのパンリサウイルスリアルタイムRT-PCR

このリアルタイムRT-PCRは、アンティモートおよび事後分析サンプルの狂犬病を迅速に診断するのに適しています。パンリサウイルスプライマーは、リサウイルス属のすべてのメンバーを識別するために最適化されています。これは、臨床検体から高度に発散した種を含むリッサウイルス属全体からのウイルスを検出する、迅速で敏感で閉管アッセイです。

OIEは最近、狂犬病感染を報告する分子アッセイを受け入れた。これは、ウイルス培養や抗原検出方法で必ずしも診断できない分解標本にとって特に重要です。このアッセイの感度により、異なる段階の分離を含む良好な実験室の練習は、汚染のリスクを最小限に抑えるために不可欠である。

手順を実証することは、私の研究室の診断士デイジー・ジェニングスです。まず、マイクロボリューム分光光度計でRNAを定量化します。機械がRNAに設定されていることを確認し、分子グレードの水の1〜2マイクロリットルを使用して機械を正規化し、ベースラインを確立します。

RNA濃度を測定し、マイクロリットル当たり1マイクログラムに調整します。テストサンプルと制御サンプルの両方を考慮して、スプレッドシートでPCRプレートのレイアウトを計画します。表面を消毒してPCRワークステーションを準備し、UVキャビネットを使用する場合は、開始の10分前にUVライトをオンにします。

冷凍庫から試薬やプライマーを取り除いて解凍しますが、酵素ミックスは常に氷の上に保ちます。試薬と遠心分離機を短時間混ぜて液体を回収します。原稿の指示に従って、リサウイルスとベータアクチンのPCRマスターミックスを準備します。

マスターミックスは、使用する準備ができるまで氷の上に残します。調製したマスターミックスを混合し、遠心分離 PCR マシン互換プレートまたはチューブストリップの関連ウェルに 19 マイクロリットルを分配します。別の部屋またはUVキャビネットに、調製したRNAの1マイクロリットルを慎重に加える。

UV キャビネットを使用する場合は、開始の 10 分前に UV ライトをオンにします。テスト サンプルの後に、正のコントロールとテンプレートなしコントロールを追加します。マスターミックスにRNAを追加する場合は、正しいウェルにRNAが追加されていることを確認してください。

この手順を支援するためにプレート計画を使用します。蓋がプレート全体に平らであることを確認するプレートをシールし、それを回転させ、井戸の底にあるすべての液体を収集します。各井戸が同じ量の液体を持ち、泡が見えないようにします。

次に、サンプルを PCR マシンに移します。解離でSYBRグリーンを選択してプログラムを開きます。蛍光色素として未知の試料タイプを選択し、SYBRを選択して分析するウェルを選択します。

プレートレイアウト上のウェルに、リッサウイルスLまたはβアクチンのアッセイがあるかどうかを含むサンプル情報でラベルを付けます。サーモプロファイルの設定をクリックし、原稿で指定された熱循環条件を変更します。[start] をクリックしてファイルを保存する場所を選択し、実行終了時にランプをオフにするチェックボックスをオンにします。

ランプのウォームアップ前に開始するオプションが表示されたら、[今すぐ実行] をクリックしますが、ランプがウォームアップするまで 15 分未満であることを確認します。PCR の実行が完了したら、データ分析を続行します。まず、リッサウイルス増幅プロットを解析する。

正のサンプルは指数ランプを表示し、負のサンプルには CT 値のないフラットな増幅プロットがあります。次に、試験サンプルのリサウイルス解離曲線結果を対照サンプルと一緒に解析する。リサウイルス陽性サンプルは、摂氏77度から80度の融解温度を有し、正のコントロールと重なります。

次に、Β-アクチン増幅プロットと解離曲線を、コントロールと比較して解析し、全体の結果を解釈します。テキスト レポートを表示し、詳細を使用してコントロール カードにコントロール RNA で取得した CT 値と TM 値を記録して、実行が成功し、テスト サンプルの結果が報告されることを確認します。このプロトコルは、対照標準ウイルスのRNA希釈系列に対するパン・リサウイルスRT-PCRの感度を実証するために使用されます。

増幅曲線は、Lyssavirusのピコグラムがわずか10個検出可能であり、解離曲線が製品の融解温度を検証できることを示しています。溶融温度は、アンプリコンがリサウイルス特異的であることを確認するために使用されます。この結果は、摂氏77.34~79.67度のリッサウイルス属にわたる融解温度範囲を示している。

融解温度値が 76.8 以下または 80.2 を超えると、非特異的と見なされます。このRT-PCRアッセイの感度は、3つのリッサウイルス陽性脳サンプルからRNAを検出することによっても決定されます。3つのサンプルのうち2つについて、標的RNAのマイクロリットル当たりわずか0.1ピコグラムを検出できます。

特に、すべての認識されたリサウイルス種の代表者は、このアッセイを使用して検出される。唾液やCSFなどの臨床サンプルからRNA抽出物を分析すると、宿主核酸がないためにβ-アクチンの結果が陰性になる可能性があります。外因性制御を追加すると、この問題が解決する場合があります。

狂犬病感染の地理的および宿主の起源に関する追加情報を提供するために、リサウイルス陽性サンプルのシーケンシングが推奨される。リサウイルス陽性または疑わしい陽性サンプルの取り扱いは、地域の安全衛生ガイドラインに従う必要があります。抽出されたRNAは非感染性であるため、低封じ込めラボ内で取り扱うことができます。