Name: ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶ 前方遺伝学的手法を用いてDrosophila melanogasterで神経変性に関与する新規神経保護遺伝子を同定する方法。クライミングアッセイと組織学的解析により、アルツハイマーやパーキンソン病などの神経変性疾患の治療標的探索に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、遺伝的スクリーンが行われた研究室で、神経保護遺伝子としてのブラットの同定と特徴付けを可能にしたバリー・ガネツキー博士に特に感謝しています。私たちは、この記事で提示された遺伝的スクリーンで使用されるENU変異ハエのコレクションを親切に提供してくれたスティーブン・ロビナウ博士に感謝します。ガネツキー研究所のメンバー、グレース・ボーコフ・ファルク博士、デビッド・ワッサーマン博士に感謝申し上げます。ウィスコンシン大学、キム・ラッキー博士、アラバマ大学光学分析施設

<ol><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+cycle%3A+the+neuron+itself+and+its+circumstances%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li>
<li>Aranda-Anzaldo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-mitotic+state+in+neurons+correlates+with+a+stable+nuclear+higher-order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.</a> Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).</li>
<li>Haelterman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+chemically+induced+mutations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).</li>
<li>Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+forward+with+genetics%3A+recent+technological+advances+and+forward+genetics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice.</a> The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).</li>
<li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing%3A+The+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+microRNA+miR-8+tunes+atrophin+levels+to+prevent+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila.</a> Cell. 131 (1), 136-145 (2007).</li>
<li>Helfrich, C., Engelmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian-Rhythm+of+the+Locomotor-Activity+in+Drosophila-Melanogaster+and+Its+Mutants+Sine+Oculis+and+Small+Optic+Lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes.</a> Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , Foundation for Statistical Computing. (2008).</li>
<li>Bokel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+screens+%3A+from+mutagenesis+to+screening+and+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Bioogyl%22%5BJournal%5D)">EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping.</a> Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).</li>
<li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsley%2C+DL+%22The+Genome+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Genome of Drosophila Melanogaster</a>. , (1992).</li>
<li>Cook, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+chromosomal+deletions+to+provide+extensive+coverage+and+subdivision+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome.</a> Genome Biology. 13 (3), R21(2012).</li>
<li>Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Mutation+in+Brain+Tumor+Causes+Both+Neural+Over-Proliferation+and+Neurodegeneration+in+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila.</a> Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).</li>
<li>Gloor, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+repressors+of+P+element+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Type I repressors of P element mobility.</a> Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).</li>
<li>Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+specifies+intermediate+progenitor+cell+identity+by+attenuating+beta-catenin%2FArmadillo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity.</a> Development. 141 (1), 51-62 (2014).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Loewen, C. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Nuclear+Interactions+Affecting+Lifespan+and+Neurodegeneration+in+a+Drosophila+Model+of+Leigh+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li>
<li>Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnr1+mutations+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+by+activating+the+innate+immune+response+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).</li>
<li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+brain%3A+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Polo+ameliorates+APP-induced+Alzheimer%27s+disease-like+symptoms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 16816(2015).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagens%2C+transposons%2C+and+transgenes+to+interrogate+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 15-28 (2014).</li>
<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Genome+Sequencing+and+a+New+Bioinformatics+Platform+Allow+for+Rapid+Gene+Identification+in+D.+melanogaster+EMS+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens.</a> Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila.</a> Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しない。

ショウジョウバエにおける前方遺伝スクリーンは、加齢依存性神経保護5、23、24、および、異なる生物学的プロセスに関与する遺伝子を同定するための効果的なアプローチであった。25.この戦略を用いて、我々は新しい神経保護遺伝子17としてブラットを同定することに成功した。
このプロトコルの重要なステップの1つは、ヒスロジー分析のためのヘッドの適切な向き(セクション4.4.3.で説明されているように)を含みます。さらに、マイオティックマッピングに使用される線のマーカーは、新しい変異の表現型を妨げるべきではない(本研究:神経変性)。我々は、選択されたマーカーが自分自身の神経変性を引き起こさないことを確認するために、最初のテストをお勧めします。例えば、...

ニューロンは、ほとんどの部分は有人性のポスト・マイトティックのためのものであり、1、2を分割することができません。ほとんどの動物では、神経保護機構は、特にニューロンが損傷に最も脆弱である老年期に、生物の寿命を通じてこれらの細胞を維持するために存在する。これらのメカニズムの基礎となる遺伝子は、神経変性を示す変異体、前方遺伝プロトコルを使用して、神経保護の喪失のための目の前の指標で同定することができる。エチルメタンスルホン酸エチル(EMS)やN-エチル-N-ニトロスア(ENU)などの化学変異を用いた前方遺伝スクリーンは、それらが誘発するランダムな点突然変異のために特に有用であり、本質的に公平なアプローチをもたらし、光を当てた本質的に公平なアプローチをもたらす真核生物モデル生物3,4,5における多数の遺伝子機能(対照的に、X線変異はDNA切断を作成し、点突然変異6ではなく再配列を引き起こす可能性がある)。
一般的なフルーツフライショウジョウバエメラノガスターは、その高品質、よくアノテートゲノム配列、高度に発達した遺伝的ツールを持つモデル生物としての長い歴史、そして最も重要な、その共有のために、これらの画面のための理想的な被験者です人間との進化史7,8.このプロトコルの適用性の制限要因は、変異した遺伝子によって引き起こされる早期致死性であり、これは9歳での試験を妨げるだろう。しかし、非致死的変異の場合、負のジオタキシスを利用する登山アッセイは、単純であるが、広範であるが、運動機能障害を定量化する方法10である。十分な運動反応性を示すために、ハエは方向を決定し、その位置を感知し、動きを調整するために神経機能に依存する。したがって、刺激に応答してハエが十分に上昇することができないことは、神経学的欠陥11を示すことができる。特定の欠陥クライミング表現型が同定されると、脳組織の組織学的分析などの二次スクリーンを用いてさらなる試験を行い、クライミング欠陥ハエにおける神経変性を同定するために使用することができる。その後の遺伝子マッピングは、目的の欠陥のある神経保護遺伝子を運ぶ染色体上のゲノム領域を明らかにするために使用することができる。目的の染色体領域を絞り込むため、染色体上に既知の位置を有する支配的なマーカー遺伝子を運ぶ変異型フライラインを用いたマイオティックマッピングを行うことができる。マーカー遺伝子は、2つの遺伝子座間の組み換えの頻度が遺伝子のおおよその位置をマッピングするために使用できる測定可能な距離を提供するように、突然変異の基準点として機能します。最後に、目的の染色体領域にバランスのとれた欠陥を運ぶ線と変異線を交差させるには、その既知の表現型が発現された場合に目的の遺伝子を検証できる補体試験が作成される。同定された遺伝子における多形性ヌクレオチド配列は、おそらくアミノ酸配列の変化をもたらし、遺伝子をシーケンシングし、それをショウジョウバエのゲノム配列と比較することによって評価することができる。目的の遺伝子のその後の特徴付けは、追加の変異性ア列のテスト、突然変異救助実験および追加の文型の検査を含むことができる。

<table><tbody><tr><td>主要機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織学</td><td></td><td></td><td></td>用ヒュームフード</tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリペE100</td><td>イメージングに適した対物レンズは20倍</td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly pushing and climbing assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg;ショウジョウバエバイアル、ナ</td><td>ローVWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg;汎用実験室用ラベリングテープ</td><td></td><td>VWR89097-912</td><td></td></tr><tr><td>標準マウスパッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>モティック</td><td></td><td>モデルSMZ-168</td></tr><tr><td>CO2麻酔ステーション(ブローガン、フットバルブ、アルティメットフライパッド)</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>54-104、59-121、59-172</td><td>Doesn'CO2タンク</td></tr><tr><td>ファインチップブラシ</td><td>SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophilaインキュベータ</td><td>ーVWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Gene mapping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila ライン 組換えマッピングに使用</td><td>ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター</td><td>3227</td><td>遺伝子型: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>Drosophila balancer line used for recombination mapping</td></tr><tr><td>Deficiency Kit for chromosome 2L</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Histology analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, (100%)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&trade;&nbsp;プレミアムマイクロ遠心チューブ:1.5mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Histochoiceクリアリングエージェント1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;&nbsp;リチャード・アラン・サイエンティフィック&トレード;取り付け媒体</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Unifrost Poly-L-Lysine 顕微鏡スライド、75 mm x 25 mm x 1 mm、EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade;&nbsp;カバーメガネ:長方形フィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>12-545M</td><td>寸法:24ミリメートル×60ミリメートル</td></tr><tr><td>トレーサブ</td>ル<td>タイマーVWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドウォーマー</td><td>バーンステッド国際</td><td></td><td>モデル番号26025</td></tr><tr><td>スライドトレイとラックDWK</td><td>ライフサイエンス</td><td></td><td>ラック20</td></tr>スライドを保持するためにフィ<tr><td>ッシャーブランド&貿易;&nbsp;汎用超長鉗子</td><td>フィッシャーブランド</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ&貿易;</td><td>キンバリー・クラーク&貿易;プロフェッショナル&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6インチピューリタンアプリケーター</td><td>広葉樹製品会社、メイン州ギルフォード</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg;かみそりの刃</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr>流<tr>水のための組織学の液体<td></td><td></td><td>16 + 1</td><td>のためのタッパーウェアかガラス容器</td></tr><tr><td>ハイプロファイルコーティングされたミクロトームブレード</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade;&nbsp;蓋付き丸型アイスバケツ、4リットル</td><td>コーニング&貿易;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビーカー</td><td></td><td></td><td>または氷水およびカセットのための他の容器</td></tr><tr><td>ティッシュ バス</td><td>精密科学的な会社</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ バイオシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ分子analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg;SVゲル&PCRクリーンアップシステム</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Ex Taq DNAポリメラーゼ</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu;l</td></tr><tr><td>Invitrogen&trade;&nbsp;SYBR&trade;セーフ&トレード;DNAゲル染色&nbsp;</td><td>&nbsp;Invitrogen&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウルトラピュア&トレード;アガロース</td><td>&nbsp;Invitrogen&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb plus DNAラダー</td><td>&nbsp;Invitrogen&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApE-Aプラスミドエディタソフトウェア</td><td></td><td></td><td>無料でダウンロード可能</td></tr><tr><td>Statistical analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rソフトウェアパッケージ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Further analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO;博士[1]/TM3, Sb[1]</td><td>ブルーミントン・ショウジョウバエ・ストック・</td><td>センター59967</td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

神経変性疾患の発症と進行について理解する多くがあります, 責任を負う基礎となる遺伝子を含む.化学変異原を用いた前方遺伝子スクリーニングは、ヒトと保存された細胞経路を共有するショウジョウバエおよび他のモデル生物の間で変異型を遺伝子にマッピングするための有用な戦略である。目的の変異遺伝子がハエの発達初期の段階で致死的でない場合、クライミングアッセイは、低上昇率などの脳機能低下の表現型指標をスクリーニングするために行うことができる。続いて、脳組織の二次組織学的解析は、神経変性型をスコアリングすることにより遺伝子の神経保護機能を検証するために行うことができる。遺伝子マッピング戦略には、これらの同じアッセイに依存するメオティックおよび欠乏マッピングが含まれており、その後にDNAシーケンシングを行い、目的の遺伝子におけるヌクレオチドの変化の可能性を特定することができます。

このエアチクルでは、成人ハエにおける神経完全性の維持(例えば、神経保護)の維持に役割を果たす遺伝子脳腫瘍(ブラット)を同定するために用いられるステップを提示する17;神経保護に関与する遺伝子を同定するために使用できる方法論。我々は、前方遺伝的アプローチ(図1Aに概説されている戦略)を用いて、クライミングアッセイを用いて化学的に変異したハエのコレクションをスクリーニングした(このアッセイに使用される装置は図1Bに示されている)。235本のホモ接合線のうち、試験されたラインの約37%が10-12日齢で試験した場合、50%以下の上昇合格率を示した(図1C)。テストされたラインの58%は、一方通行のANOVA(図1D)を使用して、テストされたすべてのラインの平均...

我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

このプロトコルの主な目標は、不安定化が神経変性につながる遺伝子を同定するために、フォワード遺伝学の力を利用することです。この技術の主な利点は、哺乳類モデルで実行することがより困難である可能性のある神経保護遺伝子の同定のための公平で簡単なアプローチを提供することです。この技術は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの多くの疾患状態に関連する神経変性の過程に関与する新しい遺伝子を同定するために使用することができる。神経保護遺伝子の同定に加えて、前方遺伝的アプローチは、神経機能および伝達などの他の生物学的プロセスに関与する遺伝子を発見するために使用することができる。まず、第2染色体にマッピングされたショウジョウバエ変異体のENU変異体化コレクションに属する線からホモ接合ハエを収集する。10〜12日齢のハエを麻酔なしで試験室にひっくり返し、5分間回復することができます。5センチメートルのラインマークを下にして、固体表面に置かれたマウスパッドの上にチャンバーを3回強制的にタップして、すべてのハエが下部でアッセイを開始します。10秒間、飛ぶ移動を観察します。この時間内に5センチメートル線に到達または通過するハエの数と、テストされたハエの総数を記録します。1 分待ってから、2 回目のトライアルを開始します。1 行あたり最低 3 回の試行の反復を繰り返します。二酸化炭素パッドでハエを麻酔した後、外科用ブレードで頭を切断し、ペイントブラシを使用してカーノイの固定剤の1ミリリットルに優しく1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れます。その後、一晩摂氏4度でチューブを保存します。翌日、固定溶液でヘッドが沈んでいるか確認してください。ヒュームフードの下で、P1000ピペットを使用して固定溶液を70%エタノールの1ミリリットルに置き換え、将来の分析のためにサンプルを摂氏4度に維持します。パスツールピペットを使用して、固定ヘッドをマイクロバイオプシーカセットに移し、カセットを閉じます。カセットを組織学施設に送って処理したり、現場で利用可能な場合は自動組織処理機に入れます。プログラムを実行して、パラフィンで頭を脱水し、クリアし、浸透させます。その後、60°Cで加熱されたパラフィンでパラフィン埋め込みステーションにカセットを移し、加熱されたステーションにカセットに収まる金属ベース金型を配置します。細かい鉗子を使用して、ヘッドの向きを基にして、ベースモールドの上部に向かうようします。正しい頭部の向きは、神学分析にとって重要です。硬化後、各パラフィンブロックをトリミングして、切り離される表面を最小限に抑えます。マイクロトーム上の各ブロックの5マイクロメートルのセクションをカットします。次に、断切したパラフィンリボンを熱湯浴に35°Cで最大5分間置きます。ポリリジンコーティングされたスライドを温水浴に浸し、木製のアプリケーターを使用して、切り離されたリボンをスライドに配置します。スライドの空気を室温で一晩乾燥させます。翌日、スライドウォーマーを使用して、スライドを摂氏63度で15分間加熱します。ヒュームフードの下にスライドを置き、スライド染色ラックに置き、ヒストチョイスにラックを5分間2回置き、その後、原稿に従っていくつかのエタノールと蒸留水浴処理を行います。ラックをハリス・ヘマトキシリンで満たされた容器に2~5分間移して汚します。その後、ヘマトキシリン溶液からラックを取り出し、次の染色手順の前に10分間水道水の下に置きます。鉗子を使用して染色した後、ヒストチョイスまたはキシレン溶液からスライドを取り出します。サンプルに永久取り付け媒体の薄い層を滴下し、上にカバースリップをそっと置きます。気泡の形成を避ける。取り付け媒体が硬化した後、スライドを軽い顕微鏡の下に置き、およそ中脳で代表的な脳切片の画像を得る。まず、ヘテロ接ゴス雌ハエを発生させるバイアルを含む食品を準備する。二酸化炭素麻酔の後、ペイントブラシを使用して、突然変異線の5人の男性と、星膜詰まったローブの10人の処女女性を移送し、カーリーOラインを介し十字架を作ります。バイアルを摂氏25度に置きます。10〜12日後、変異した染色体とマーカー染色体を運ぶ少なくとも15人の処女女性子孫を収集する。スカットイドまたは同等の上に別の可視支配的なマーカーカーリーOを運ぶバランスのとれたラインから5人の男性にそれらを渡ります。10〜12日後、スキュトイドまたはカーリーOのいずれかを運ぶヘテロ接合性男性の子孫と、十字架から再結合する可能性のある染色体を収集します。変異した染色体を運ぶストックから処女女性にそれらを個別に合致させる。10〜12日後、バイアルを含む新しい食品に最後の十字架から子孫を収集し、10〜14日に摂氏29度でハエを老化させます。フライヘッドで組織学を実行し、個々のクロスの子孫のために繰り返します。この情報により、染色体の狭い領域に対して欠乏性マッピングを行い、劣性突然変異の位置を微細化する。各欠乏線は、染色体の異なる領域の欠失を有し、それらを相補試験に使用することを可能にする。次に、第2染色体のショウジョウバエ欠損キットからのクロスラインを、目的の表現型の非相補性を探す。DNA配列解析の参照を得るには、BraT遺伝子のゲノムコンセンサス配列を含むFASTAフォーマットファイルをFlyBaseからダウンロードするか、遺伝的背景制御のBRAT配列の結果を含むファイル(例えば、もともと変異型ショウジョウバエ線)を使用します。A プラスミド エディタでシーケンス ファイルを開きます。[編集] に移動し、[シーケンスの整列] をクリックします。コンピュータのマウスを使用して、比較するすべてのシーケンスを選択します。ドロップ メニューで、この配置の参照順序を指定します。配列配列領域に、参照配列と比較してヌクレオチド変化がないか調べる。必要に応じて、テキストをクリックして、RTF形式でコンピュータ上の配置を保存し、保存します。各十字架からF1子孫を集めて救助実験を行います。マーク付きのバランサーを慎重に選択します。ショウジョウバエの食品培地でハエを摂氏29度で老化させ、脳の占頭分析を行い、以前のように神経変性を探す。867変異体における神経変性の年齢依存性分析を行うために、ハエを5、15、25日に老化させ、その後の占体分析を行う。このプロトコルは、クライミングアッセイを使用して化学的に変異したハエのコレクションを通してスクリーニングするための前方遺伝的アプローチを提示する。235本のホモ接合線のうち、試験ラインの約37%が10〜12日の年齢で試験した場合、50%未満の上昇合格率を示した。最も低いクライミング合格率を示す51行の続く組織学的スクリーンは、これらのラインの29が軽度から重度の神経変性を示す脳神経剤の穴の目に見える外観を示すことを明らかにした。867ハエの神経変性表現型は、野生型株に交差したヘテロ接合867ハエの脳がコントロールのものと同等であったため、劣性である。欠損線Df24116は、クライミングアッセイに基づく867変異表現型を補うものではありません。組織学的検証は、Df24116が867神経変性表現型を補完しない欠乏線を示すが、Df9296はそうする。867変異体の脳表現型を調べて、追加の欠乏ラインに交差し、遺伝子BRATを含むゲノムの領域に突然変異が含まれていることが確認された。この手順の間に、このプロトコルは、不適切に実行された場合、候補遺伝子の神経変性と変異体の同定に影響を与えることができるいくつかのステップを組み合わせるので、可能な限り厳格かつ正確に動作することを覚えておくことが重要です。同定された遺伝子に応じて、その後の分析には、目的の遺伝子の追加の排卵の試験または神経変性の既知の経路において役割を果たす遺伝子との相互作用が含まれ得る。体生の手順では、カルノイの固定液はクロロホルムが含まれているため、注意して処理してください。手袋を着用し、ヒュームフードの下で理想的に十分な換気で使用してください。同様に、ヒュームフードの下ですべてのヒストロジー染色を行います。

in-vivo-forward-genetic-screen-to-identify-novel-neuroprotective

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

用いて、化合物の生理活性をスクリーニングするためのペアNanoinjectionと電気生理学的アッセイキイロショウジョウバエジャイアントファイバシステム

このビデオでは、ハエの移動を定量化する簡単な方法と、実施されたクライミングアッセイを示しています。フライクライミングアッセイは、ジオタクシスの負の反応に依存する運動機能の一般的なテストです。...

フライクライミングアッセイ:Drosophila melanogasterの一般的な移動をテストする方法

ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する...

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

ここでは、としてショウジョウバエ感覚ニューロンの樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデルは、体内を組み合わせたライブ イメージング、2...

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエメラノガスターにおける生体内実験の設計と性能を概説し、ヒト疾患に関連する希少遺伝子変異体の機能的影響を評価することです。...

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

血液脳関門の完全性は、神経系の機能のために重要です。ショウジョウバエメラノガスターでは、血液脳関門は後期胚形成時にグリア細胞によって形成される。このプロトコルは、D.メラノガスター胚および第3の恒星幼虫における血液脳関門形成および維持に関するアッセイ方法について説明する。...

ショウジョウバエメラノガスターにおける血液脳関門完全性に関するアッセイ

この記事では、成人 ショウジョウバエ...

ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

このプロトコルは、従来の哺乳類モデルに代わるものとして、自発運動機能障害の定量化を通じてショウジョウバエの神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。これは、高感度で再現性があり、倫理的に有利なモデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目的としています。...

神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

我々は遺伝的にウスチラゴがmaydisスマット菌を操作する堅牢な遺伝子置換戦略を説明します。このプロトコルは、感染症の表現型を調べるために、欠失変異体を生成する方法について説明します。蛍光タンパク質タグをコードする配列を付加することによって、 例えば 、任意の所望の方法で遺伝子を修正するために拡張することができます。...

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

学ぶ 前方遺伝学的手法を用いてDrosophila melanogasterで神経変性に関与する新規神経保護遺伝子を同定する方法。クライミングアッセイと組織学的解析により、アルツハイマーやパーキンソン病などの神経変性疾患の治療標的探索に貢献します。

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

さらに動画を探す