-1::1
Simple Hit Counter
Skip to content

Products

Solutions

×
×
Sign In

JA

EN - EnglishCN - 简体中文DE - DeutschES - EspañolKR - 한국어IT - ItalianoFR - FrançaisPT - Português do BrasilPL - PolskiHE - עִבְרִיתRU - РусскийJA - 日本語TR - TürkçeAR - العربية
Sign In Start Free Trial

RESEARCH

JoVE Journal

Peer reviewed scientific video journal

Behavior
Biochemistry
Bioengineering
Biology
Cancer Research
Chemistry
Developmental Biology
View All
JoVE Encyclopedia of Experiments

Video encyclopedia of advanced research methods

Biological Techniques
Biology
Cancer Research
Immunology
Neuroscience
Microbiology
JoVE Visualize

Visualizing science through experiment videos

EDUCATION

JoVE Core

Video textbooks for undergraduate courses

Analytical Chemistry
Anatomy and Physiology
Biology
Cell Biology
Chemistry
Civil Engineering
Electrical Engineering
View All
JoVE Science Education

Visual demonstrations of key scientific experiments

Advanced Biology
Basic Biology
Chemistry
View All
JoVE Lab Manual

Videos of experiments for undergraduate lab courses

Biology
Chemistry

BUSINESS

JoVE Business

Video textbooks for business education

Accounting
Finance
Macroeconomics
Marketing
Microeconomics

OTHERS

JoVE Quiz

Interactive video based quizzes for formative assessments

Authors

Teaching Faculty

Librarians

K12 Schools

Products

RESEARCH

JoVE Journal

Peer reviewed scientific video journal

JoVE Encyclopedia of Experiments

Video encyclopedia of advanced research methods

JoVE Visualize

Visualizing science through experiment videos

EDUCATION

JoVE Core

Video textbooks for undergraduates

JoVE Science Education

Visual demonstrations of key scientific experiments

JoVE Lab Manual

Videos of experiments for undergraduate lab courses

BUSINESS

JoVE Business

Video textbooks for business education

OTHERS

JoVE Quiz

Interactive video based quizzes for formative assessments

Solutions

Authors
Teaching Faculty
Librarians
K12 Schools

Language

ja

EN

English

CN

简体中文

DE

Deutsch

ES

Español

KR

한국어

IT

Italiano

FR

Français

PT

Português do Brasil

PL

Polski

HE

עִבְרִית

RU

Русский

JA

日本語

TR

Türkçe

AR

العربية

    Menu

    JoVE Journal

    Behavior

    Biochemistry

    Bioengineering

    Biology

    Cancer Research

    Chemistry

    Developmental Biology

    Engineering

    Environment

    Genetics

    Immunology and Infection

    Medicine

    Neuroscience

    Menu

    JoVE Encyclopedia of Experiments

    Biological Techniques

    Biology

    Cancer Research

    Immunology

    Neuroscience

    Microbiology

    Menu

    JoVE Core

    Analytical Chemistry

    Anatomy and Physiology

    Biology

    Cell Biology

    Chemistry

    Civil Engineering

    Electrical Engineering

    Introduction to Psychology

    Mechanical Engineering

    Medical-Surgical Nursing

    View All

    Menu

    JoVE Science Education

    Advanced Biology

    Basic Biology

    Chemistry

    Clinical Skills

    Engineering

    Environmental Sciences

    Physics

    Psychology

    View All

    Menu

    JoVE Lab Manual

    Biology

    Chemistry

    Menu

    JoVE Business

    Accounting

    Finance

    Macroeconomics

    Marketing

    Microeconomics

Start Free Trial
Loading...
Home
JoVE Journal
Immunology and Infection
フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食...
フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食...
JoVE Journal
Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Immunology and Infection
Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

Full Text
7,245 Views
09:43 min
December 7, 2019

DOI: 10.3791/60397-v

Susann Hartung1,2, Christopher Rauh2, Sarah Böttcher1, Mai Thi Ngoc Hoang1,2, Susanne Jahreis1,2, Silke Rummler3, Andreas Hochhaus2, Marie von Lilienfeld-Toal1,2

1Infections in Hematology and Oncology,Leibniz Institute for Infection Biology and Natural Product Research, 2Department for Hematology and Medical Oncology,Jena University Hospital, 3Institute for Transfusion Medicine,Jena University Hospital

AI Banner

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いたヒト一次食細胞によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの貪食を定量的に測定し、単なる接着から白血球へのコニジアの貪食を判別するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。

このプロトコルは、ヒト白血球による標識アスペルギルス・フミガトゥール・コニディアの貪食作用、および細胞へのコニディアの付着性、およびフローサイトメトリーによる相互作用の欠如を定量的に測定するため、重要である。この方法の主な利点は、多数の細胞の高速分析を容易にすることです。さらに、細胞マーカーの標識は、同じサンプル内の好中球および単球の評価を分離することを可能にする。

この技術では、ムコレスのような他の臨床関連菌を分析するために使用することができます。代わりに赤血球は食細胞として使用される可能性があります。.この手順を開始するには、ペーパータオルに消毒剤を入れ、バイオセーフティキャビネットに入れてください。

揮発性コニディアの過剰流通を防ぐために、ペーパータオルの上に成長したアスペルギルスフミガトゥスのプレートを置きます。真菌の上に0.01%の洗剤を含むPBSの10ミリリットルを加え、ドリガルスキースパチュラを使用してプレートの上に液体を広げ、暗い色のコニディアをこすり落とします。コニディア懸濁液を30マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルに移し、残ったミセリアを取り除きます。

洗剤付きのPBSを10ミリリットル追加し、ヘラで広げ、ストレーナーを通して同じチューブに移します。次に、0.1モル炭酸ナトリウムの無菌溶液を調製し、PBSに溶解する。この炭酸ナトリウム溶液中にFITC粉末の0.1ミリモル溶液を調製する。

このFITC溶液の5ミリリットルで、1億個以下のコニディアを15ミリリットルのチューブに再懸濁させる。摂氏37度で20分間インキュベートします。コニディアに膨らむには、10%FCSを補った5ミリリットルのRPMI培地で、適合標識されたConidiaを再中断する。

そして、所望の時間のために摂氏37度で回転器でインキュベート。バイオセーフティキャビネットでは、5ミリリットルのバフィーコートを50ミリリットルのチューブに入れる。ELバッファーでチューブを満たし、3回反転します。

混合物の乳白色の外観が明らかになるまで、5〜8分間水平にインキュベートします。その後、遠心分離機をGの300倍、室温で10分間行う。上清を捨て、ピペット処理により1ミリリットルのELバッファーにペレットを再懸濁します。

ELバッファーの別の 24 ミリリットルを追加し、チューブを数回反転します。遠心分離機はGの300倍、室温で5分間。上清を捨て、1ミリリットルのRPMI培地で細胞を再懸濁し、10%FCSを補う。

まず、10%FCSを補充したRPMIの1.5ミリリットルで200万個の白血球と400万個のFITC標識コニディアを12ウェル培養プレートに移します。コニディアのないセルのコントロールと、ラベルのない Conidia を持つセルのコントロールを含めます。所望の時間のために摂氏37度で、加湿二酸化炭素インキュベーターでプレートをインキュベートします。

インキュベーションが完了したら、細胞スクレーパーを使用して細胞を収穫し、15ミリリットルのチューブに移します。まず、各サンプルの100マイクロリットルを入れ、96ウェルVボトムプレートの1つのウェルに制御します。洗浄用のEDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。

色補償のために、各色のためのコニディアなし100万個の細胞をプレートの他の井戸に置きます。訓練を受けていないままになる細胞の井戸を含めます。洗浄用の各ウェルに、EDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。

次に、粘着ホイルでプレートを覆い、遠心分離機をGの300倍、室温で5分間覆います。その後、ホイルを取り除き、シンクまたは使い捨てのペーパータオルの上に一度だけ素早く強引にプレートを反転させることで上清を捨てます。100マイクロリットルの抗体ミックスで細胞を再懸濁し、ピペット処理でよく混ぜます。

色補償のために、EDTAの2ミリモルを含むPBSの100マイクロリットルのそれぞれの細胞を再懸濁し、抗体ミックスで使用される同じ量で各ウェルに単一の抗体タイプを加える。粘着ホイルで覆い、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。この後、ホイルを取り除き、洗浄のために各ウェルにEDTAの2ミリモルを含むPBSの150マイクロリットルを加えます。

もう一度粘着ホイルでプレートを覆います。遠心分離機はGの300倍、室温で5分間。その後、ホイルを取り出し、シンクまたは使い捨てのペーパータオルの上にプレートを素早く強引に反転させることで上清を捨てます。

2ミリモルEDTAを含むPBSの200マイクロリットルの細胞を再懸濁し、各ウェルから細胞懸濁液を別々の丸底管に移す。フローサイトメーターを開始し、ウォームアップさせます。取得ソフトウェアで、新しい実験を作成し、新しいサンプルを設定してラベル付けします。

テキスト プロトコルで説明されているように、適切な蛍光器のパラメータと検出器を設定します。このソフトウェアでは、テキストプロトコルで概説されているように、適切なドットプロットを表示します。サンプルのみを使用して、いくつかの細胞を取得し、白血球の周りにゲートを設定します。

白血球ゲートに基づいて、CD45陽性細胞用のゲートは、SSC CD45プロット中のコニディアから分離する。ドットプロットにおいて、CD14、CD66b、ゲート好中球および単球は別々に。この後、細胞のみをサンプルから、ラベルなしのConidiaに変更する。

ドットプロットでは、アンチFITC、APC FITCは、アンチFITC、およびFITC信号の設定象限に好中球を表示します。統計ビューを開き、四分の一の四分の一を調整して、クアドラントのセルの最大 1%を使用できるようにします。単球ゲートに対してこのプロセスを繰り返します。白血球ゲートでは、少なくとも20,000のイベントですべてのサンプルを記録します。

ヒト好中球によるFITC標識コニディアの貪食細胞症は、統計図から読み取ることができる。本研究では、高速フローサイトメトリック法を用いて、多数の原発性ヒト白血球とのアスペルギルス・フミガトゥール・コニディアの相互作用を測定する。ここに示す適切な抗体および格子戦略を用いて、FSCおよびSSC特性によるヒト白血球の一般的な格子化は、遊離コニディアにおける白血球の分離に続き、パン白血球マーカー、CD45によって行う。

Conidiaは、フローサイトメトリーの時点で、特に腫れたコニディアを使用する場合、または長いインキュベーション時間を使用すると、ほぼ細胞サイズに達することができ、したがって、私たちの分析を購入することができます。ヒトの一次単球と好中球は異なる方法でConidiaを取るので、このプロトコルは、確立された細胞系統マーカー、単球のCD14、好中球のためのCD66bで染色することに基づいて、これらの細胞集団の別々の分析を可能にする。コニディアを内在化するヒト原発食細胞の割合は、献血者の間で非常に変動する可能性があるが、また、インキュベーション時間およびコニディアの腫脹状態などの実験的要因に依存する。

胞子の内在化は、共培養の0.5時間後に検出することができ、時間とともに増加する。腫脹前のコニディアは、短い孵化時でさえ、胞子を休ませるよりも簡単に取り上げられる。コニディアがホルムアルデヒドで固定されている場合、食道はネイティブコニディアと比較して減少する。

この手順に従って、共インキュベート免疫細胞とConidiaの上清を収集し、その相互作用が免疫細胞によるサイトカイン放出を引き起こすかどうかを確認するために、Elizaによって分析することができる。人間の血液は感染症を伝染させる可能性があります。この作業では、B型肝炎全体のワクチン接種、バイオセーフティキャビネットの使用、ラボコートでの手袋の着用が必要です。

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Sign In Start Free Trial

Explore More Videos

免疫学と感染症 問題 154 食細胞症 フローサイトメトリー アスペルギルス フミガトゥス コニディア FITC 抗FITC抗体 アスペルギルス症

Related Videos

ヒト食細胞による真菌性胞子食作用の定量的フローサイトメトリー測定

05:28

ヒト食細胞による真菌性胞子食作用の定量的フローサイトメトリー測定

Related Videos

434 Views

寄生虫感染赤血球の抗体媒介性食作用の定量化のためのアッセイ

06:56

寄生虫感染赤血球の抗体媒介性食作用の定量化のためのアッセイ

Related Videos

419 Views

初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価

02:22

初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価

Related Videos

345 Views

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

07:58

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

Related Videos

13.3K Views

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

09:04

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

Related Videos

11.8K Views

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング A。フミガーツス

12:29

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング A。フミガーツス

Related Videos

10.6K Views

アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

09:52

アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

Related Videos

10.9K Views

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

09:57

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

Related Videos

6.8K Views

全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

15:01

全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

Related Videos

3.7K Views

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

07:21

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

Related Videos

1.8K Views

JoVE logo
Contact Us Recommend to Library
Research
  • JoVE Journal
  • JoVE Encyclopedia of Experiments
  • JoVE Visualize
Business
  • JoVE Business
Education
  • JoVE Core
  • JoVE Science Education
  • JoVE Lab Manual
  • JoVE Quizzes
Solutions
  • Authors
  • Teaching Faculty
  • Librarians
  • K12 Schools
About JoVE
  • Overview
  • Leadership
Others
  • JoVE Newsletters
  • JoVE Help Center
  • Blogs
  • Site Maps
Contact Us Recommend to Library
JoVE logo

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved

Privacy Terms of Use Policies
WeChat QR code