Name: 腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶ腸内調節制御T細胞誘導法。樹状細胞を用いて炎症環境下でも安定した免疫寛容誘導を実現し、活性型ビタミンDとAの免疫調節メカニズムを解明する革新的治療戦略です。

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この作品は、第1報のピアレビュー医学研究プログラムを通じて、国防次官補事務局の支援を受けました。W81XWH-15-1-0240 (XT)意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されるものではありません。この研究はまた、ロマリンダ大学医学科(681207-2967[XTとGG]、681205-2967[XT]、および325491[DJB])からの研究イノベーション助成金によって部分的にサポートされました。

生体内動物研究プロトコルはすべて、ロマリンダ大学の動物ケアと使用委員会(IACUC)と米国陸軍医学研究・マテリエルコマンド(USAMRMC)の動物ケアと使用レビューオフィス(ACURO)によってレビューされ、承認されました。国防総省
1. 1α-ヒドロキシラーゼとRALDH2(レンズCYP-ALDHウイルス)の両方を発現するレンチウイルスの調製
<ol><li>0日目:早朝、CM-10-D細胞培養培地中の293T細胞の5x105細胞/mLを調製する。</li>
	<li>150 mm x 25 mm の培養料理で 20 mL/プレートをシードします。細胞を37°Cで培養し、24時間のCO2を5%培養すると、24時間後に約80~90%に達する。</li>
	<li>1 日目: 2x HBS (50 mM HEPES、280 mM NaCl、および 1.5 mM Na2HPO4、 pH 7.1) を作成します。アリコートと-20°で保存します。</li>
	<li>2 M CaCl2を作成し、室温で保管します。</li>
	<li>150mm×25mm培養皿ごとに、滅菌50mL培養管内にDNA沈殿混合物を調製する。まず、2x HBSの1,620 μL、PMD2G(VSVG)の9.5μg、pCMVR8.74(Capsid)の17.5μg、レンティCYP-ALDHプラスミド(CYP27B1とALDH1a2の両方を運ぶレンチウイルスベクター)の27μgを追加します。次に、H2O を最終容積 3,037.5°L に加えます。</li>
	<li>最後に、溶液を1x HBSおよび125 mM CaCl2の最終濃度に混合しながら、2M CaCl2の202.5 μLをドロップワイズに加えます。CaCl2は最後に追加する必要があります。トランスフェクション混合物を室温で20分間、時折混合したままにしておきます。複数の150ミリメートルx25ミリメートルの培養料理の場合は、それに応じてスケールアップ。</li>
	<li>3,240 μLのDNA沈殿混合物を、293T細胞を含む150mm x 25mm培養皿に1つに加えます。DNA沈殿混合物を加えながら、培養皿側をゆっくりと左右に旋回する。37°Cで料理をインキュベートし、24時間5%CO2でインキュベートします。</li>
	<li>2日目:リン酸カルシウムトランスフェクション液を除去し、1x PBSでやさしく洗浄し、CM-4-D細胞培養培地で細胞培養物を再供給する。細胞を37°Cでインキュベートし、24時間5%CO2でインキュベートします。</li>
	<li>3日目:無菌保管ボトルで上清を収穫し、4~8°Cで保管してください。新鮮なCM-4-D細胞培養培地で細胞培養を補充します。細胞を37°Cで培養し、さらに24時間CO2を5%培養する。</li>
	<li>4日目:上清を滅菌保存ボトルに収穫する。3日目と4日目の上清を0.45μmフィルターまでフィルターします。VSVG擬似型ウイルスを濃縮するには、上清を遠心管に移し、4°Cで24時間4,780 x gでスピンします。</li>
	<li>5日目:ペレットから上清を注ぎ(ペレットが見えることが多い)、チューブを無菌バイオセーフティキャビネットのペーパータオルに数分間流し込みます。</li>
	<li>5%グリセロールを含む滅菌PBSでピペットをピペットで再サスペンドします。サスペンションの容積は150 mm x 25 mm 培養皿あたり33.3μLになります。</li>
	<li>アリコート200°L/チューブと-80°で保存。滴定のために50°L/バイアルの別のアリコートを作ります。テッターは、108~ 109形質転換単位 (T)/mL の範囲内である必要があります。</li>
	<li>培養料理に漂白剤を加え、捨てます。 注:これらのトランスフェクトされた細胞は、すべてのレンチウイルス要素が細胞内で発現されるため、プロトコルにおける最大の安全上の懸念事項です。</li>
</ol>2. 骨髄由来DC(BMDC)の生成
<ol><li>4〜5 Balb/cマウスから培養培地6を含む50mL滅菌ポリプロピレンチューブにチビアスおよび大腿骨を収穫する。</li>
	<li>チビアスと大腿骨を100mm×20mm培養物に移し、培養培地を含む。筋などの組織を脛骨や大腿骨から取り除き、はさみや鉗子を解剖します。</li>
	<li>脛骨と大腿骨の両端をカットして骨髄腔を露出させます。</li>
	<li>30G針に取り付けた10mLシリンジに10mL培養培地を描きます。</li>
	<li>慎重に骨髄腔に針を挿入し、きれいな50 mL滅菌ポリプロピレンチューブに骨髄をフラッシュします。必要に応じてこの手順を繰り返し、骨髄が完全に洗い流されていることを確認します。</li>
	<li>遠心分離(400 x g)で骨髄細胞を2~8°Cで5分間ペレット化し、上清を吸引する。</li>
	<li>1x赤血球リシスバッファーの5 mLでペレットを再サスペンドします。</li>
	<li>時折振りながら、室温で細胞を4~5分間インキュベートします。</li>
	<li>30mLの培養培地を添加して反応を停止する。</li>
	<li>5分間2~8°Cで遠心分離(400 x g)で細胞をペレット化し、CM-10-R細胞培養培地の10mLで細胞を再サスペンドします。必要に応じて、細胞を40μmの細胞ストレーナーを通過して破片を除去することができます。</li>
	<li>CM-10-R細胞培養培地を使用して、細胞数を1x 106セル/mLに調整します。</li>
	<li>組換えマウス顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF、最終濃度=100 U/mL)とマウスインターロイキン-4(IL-4、最終濃度=10U/mL)を加えます。 注:GM-CSFおよびIL-4のストックソリューションは、それぞれ100,000 U/mL(1,000x)と10,000 U/mL(1,000x)で-80°Cで保存されています。</li>
	<li>細胞を4mL/ウェルで6ウェル培養プレートに分配し、細胞を37°Cで、5%CO2で48時間培養します。</li>
	<li>穏やかなピペットで非付着細胞を除去します。</li>
	<li>GM-CSF(100 U/mL)およびIL-4(10 U/mL)を含む新鮮なCM-10-R細胞培養培地を追加します。細胞をさらに48時間培養する。</li>
	<li>レンチCYP-ALDHウイルスによる伝達のための非付着細胞(BMdCC)を収穫する。</li>
</ol>3. DC-CYP-ALDH細胞を生成するレンチCYP-ALDHウイルスを用いたDCの導入
<ol><li>50 μLのウイルスと8μg/mLプロタミンを含むCM-10-R細胞培養培地の総体積0.5mLで1 x 106 DC/ウェルを6ウェル培養プレートに調製します。</li>
	<li>細胞を37°Cで培養し、24時間CO2を5%培養する。</li>
	<li>培地を新鮮なCM-10-R細胞培養培地に置き換え、細胞を37°Cで培養し、さらに24時間CO2を5%培養します。この時点で、1α-ヒドロキシラーゼおよびRALDH2の酵素活性を評価することができる(ステップ4参照)。必要に応じて、2 番目のトランスダクションに対して手順 3.1 ~ 3.3 を繰り返します。</li>
	<li>リポ多糖(100ng/mL)を加え、細胞を24時間培養する。</li>
	<li>実験のために細胞(DC-CYP-ALDH細胞)を採取する。</li>
</ol>4. DC-CYP-ALDH細胞における過剰発現1α-ヒドロキシラーゼおよびRALDH2の評価
<ol><li>DC-CYP-ALDH細胞における過剰発現1α-ヒドロキシラーゼの評価<ol>
<li>種子1.0 x 106 DC-CYP-ALDH細胞/ウェルCM-10-R細胞培養培地の2mLで12ウェル培養プレートに。</li>
		<li>25(OH)Dを2.5μMの最終濃度に加えます。DC-CYP-ALDH細胞を24時間インキュベートします。</li>
		<li>上清を収穫し、-20°Cで保存します。</li>
		<li>市販の放射性免疫測定法(RIA)を用いた上清中の1,25(OH)2D濃度に対するアッセイ(材料表参照)。</li>
		<li>抗CYP27B1抗体を用いて蛍光活性化細胞選別(FACS)によりDC-CYP-ALDH細胞における1α-ヒドロキシラーゼの発現を決定する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC-CYP-ALDH細胞における過剰発現RALDH2の評価 注:過剰発現ALDH2の発現および活性は、市販のアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)検出キットを用いて決定される(材料表を参照)。<ol>
<li>DC-CYP-ALDHまたは対照セルの種子1 mL(アッセイバッファー内の1 x105細胞/mL)の2つの5mLチューブ(1つは「コントロール」とラベル付けされ、もう1つは「テスト」とラベル付けされた)である。</li>
		<li>各コントロールチューブにジエチルアミノベンズアルデヒド(DEAB)溶液(95%エタノール中1.5mM)を10μL加え、すぐに混ぜます。DEAB は RALDH2 阻害剤です。</li>
		<li>5μLの活性化RALDH蛍光基板(300μM)を制御管および試験管に加え、すぐに混合します。</li>
		<li>チューブを45分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞を400 x gで2~8°Cで5分間遠心分離してペレットを与え、上清を吸引する。</li>
		<li>200μLのアッセイ緩衝液で細胞を再構成する。</li>
		<li>細胞を氷の上に置き、FACSによる分析を進めます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
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小雷唐博士とデビッド・J・ベイリンク博士は、この研究に関連する保留中の特許の発明者です。

この記事では、末梢リンパ組織における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強するためのDC-CYP-ALDH細胞の使用について説明する。我々のデータは、DC-CYP-ALDH細胞が対応する基質(すなわち、25[OH]Dおよびレチノール)の存在下でインビトロで1,25(OH)2DおよびRAの両方の局所的に高濃度のde novoを合成できることを示している。25(OH)Dとレチノールの十分な血中濃度は、欠乏症30、31を有する患者においてそれぞれビタミンDおよびA補充を介して容易に達成することができるので、我々は、DC-CYP-ALDH細胞が25(OH)Dおよびレチノの正常な血中濃度が存在する場合に末梢リンパ組織における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強することができる理由である。この推論を裏付けるために、我々のデータは、ビタミンDおよびビタミンA欠乏症を有さない正常な健康動物において、DC-CYP-ALDH細胞が調節分子(すなわち、foxp3およびIL-10)と腸ホーミング受容体(すなわち、CCR9)の...

炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GUT)における炎症性慢性疾患である。米国では、約140万人のIBD患者がいます。腸内細菌に対する調節不全の免疫応答が疾患を開始し、粘膜上皮バリア1、2を破壊することが一般的に受け入れられている。このため、現在利用可能な米国食品医薬品局(FDA)承認薬物は、炎症メディエーターの機能を阻害するか、腸内の免疫細胞のホーミングをブロックする。しかし、標的とされる炎症性メディエーターや免疫細胞も免疫防御に必要です。その結果、炎症性メディエーター阻害剤は全身免疫防御を損ない、免疫細胞ホーミング遮断薬は腸内免疫防御を弱め、いずれも重篤な結果につながる可能性がある3、4。さらに、免疫細胞ホーミングブロッカーはまた、腸内の調節T(Treg)細胞のホーミングをブロックすることができ、したがって、IBD患者における既に侵害された腸内免疫寛容を悪化させることができる。さらに、腸内へのTreg細胞ホーミングの遮断は、血液5中のTreg細胞の蓄積による全身免疫抑制にもつながる可能性がある。最後に、阻害剤およびブロッカーは一過性に機能し、それによって頻繁な投与を必要とする。これらの阻害剤およびブロッカーの頻繁な投与は、さらに不利な副作用を悪化させる可能性があります。
最近、我々は潜在的に軽減またはIBD治療のための現在の薬物に関連する副作用を排除することができる新しい戦略を提案しました6.この戦略は、末梢リンパ組織6における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強する。この戦略の根拠は、腸のホーミングTreg細胞が腸に特異的に家であり、したがって、全身性免疫防御を損なわないということです.さらに、Treg細胞は記憶7、8を形成する可能性があるため、腸内ホーミングTreg細胞はIBD患者における慢性腸炎の安定した制御を提供する可能性があり、それによって、治療を頻繁に投与する必要はない。さらに、この戦略は、生体内における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強するので、インビトロ発生Treg細胞9、10の養子移入に関連する高炎症性環境における生体内不安定性の懸念を有しない。この点に関して、in vitro生成Treg細胞は、自己免疫疾患11、12、13および移植拒絶反応14、15の治療のための提案された戦略の1つである。最後に、この戦略では、樹状細胞(DC)は、活性ビタミンD(1,25-ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)の2つの分子の局所的に高濃度を生成するように設計されています。1,25(OH)2DとRAを選んだのは、1,25(OH)2Dが調節分子(例えば、フォークヘッドボックスP3[foxp3]およびインターロイキン-10[IL-10])16、17、RAがT細胞18における腸ホーミング受容体の発現を刺激することができるからである。1,25(OH)2D と RA の両方が DC28,29を許容できるため、設計された DC が生体内の対レフォゲン状態で安定的に維持され、したがって、インビトロ生成トレロゲン DC (TolDCs)19,20,21に関連する生体内不安定性の懸念を回避する理由 .この点で、TolDCはまた、Treg細胞機能19、20、21の生体内増強のための提案された戦略の一つである。我々の推論を支持するために、我々は、設計されたDCが生体内送達時に、末梢リンパ組織6における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強できることを示した。
私たちの提案された戦略のもう一つの利点は、1,25(OH)2 Dはまた、潜在的にIBD患者に利益をもたらす可能性のある他の機能を持っているということです。これらの他の機能は、抗菌剤22の分泌を刺激し、発癌を抑制する1,25(OH)2Dの能力を含む。感染症や癌は、しばしばIBD24、25に関連付けられています。
1,25(OH)2DとRA de novoの両方の局所的に高濃度を生成できるDCを生成するために、2つの遺伝子を過剰発現するためにDCを設計するためにレンチウイルスベクターを使用しています。1つの遺伝子は、25−ヒドロキシビタミンD1α−ヒドロキシラーゼ(1α-ヒドロキシラーゼ)をコードするシトクロムP450ファミリー27サブファミリーBメンバー1(CYP27B1)であり、これは1,25(OH)2Dの合成を生理学的に触媒する。他の遺伝子は、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ2(RALDH2)をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA2(ALDH1a2)であり、RA6の合成を生理学的に触媒する。
生体内での腸内ホーミングTreg細胞誘導はIBDの治療において潜在的に重要であるため、以下のプロトコルでは、1α-ヒドロキシラーゼ-RALDH2-過剰発現DC(DC-CYP-ALDH細胞)の生成手順を詳述します。生体内の腸ホーミングTreg細胞の将来の調査に使用することができます。

<table><tbody><tr><td>10 mLシリンジ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm 培養皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>12ウェル培養プレート</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 25 mm 培養皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430559</td><td></td></tr><tr><td>25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# H4014</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>ALDEFLUOR kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>Cat# 01700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CYP27B1</td><td>Abcam</td><td>Cat#ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D 細胞培養培地</td><td></td><td></td><td>10% ウシ胎児血清 (FBS)、100 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン、0.055 mM 2-メルカプトエタノール (2-ME)、1 mM ピルビン酸ナトリウム、0.1 mM 非必須アミノ酸、および 2 mM L-グルタミンを含む DMEM 培地。</td></tr><tr><td>CM-10-R細胞培養培地</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640培地(グルタミンなし)には、10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、0.055 mM 2-メルカプトエタノール(2-ME)、1 mMピルビン酸ナトリウム、0.1 mM非必須アミノ酸、および2 mM L-グルタミンが含まれています。</td></tr><tr><td>CM-4-D細胞培養培地</td><td></td><td></td><td>4%ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、0.055 mM 2-メルカプトエタノール(2-ME)、1 mMピルビン酸ナトリウム、0.1 mM非必須アミノ酸、および2 mM L-グルタミンを含むDMEM培地。</td></tr><tr><td>Corning ボトルトップ真空フィルター、0.22 mM、500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>Corning ボトルトップ真空フィルター、0.45 mM、500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 11960044</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 16000044</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Gibco ACK lysing buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G5516</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore</td><td>Cat#391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>カスタムメイド</td>の <td>1.6 kb マウス CYP27B1 および ALDH1a2 cDNA をそれぞれ CYP27B1 cDNA を含むプラスミドと ALDH1a2 cDNA を含むプラスミド (GeneCopoeia) を使用して PCR により増幅しました。5'コザックCYP27B1リボソームエントリー配列で増幅された cDNA断片をpRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPREレンチウイルスベクター(Addgene)にクローニングしました。得られたコンストラクトをlenti-CYP-GFPと命名しました。増幅されたALDH1a2 cDNA断片をlenti-CYP-GFPにクローニングしてGFPを置換し、lenti-CYP-ALDHと命名しました。このビシストロンプラスミドは、SFFVプロモーターによって制御されるCYP27B1を発現し、PGKプロモーターによって制御されるALDH1a2を発現します。</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3755</td><td></td></tr><tr><td>マウス GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 315-03</td><td></td></tr><tr><td>マウス IL-4</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>Needles</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 22036</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#15140148</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩バランス溶液 (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#:20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid#12259</td><td></td></tr>ポリプロピレン<tr><td>チューブ、15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#AM12500</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンチューブ、50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#P3369</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>ポリクローナルIgGアイソタイプコントロール</td><td>アブカム</td><td>Cat# ab171870</td><td></td></tr><tr><td>1,25(OH)2D測定のためのラジオイムノアッセイ</td><td>ハートランドアッセイ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640中、グルタミンなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Cat# 21870076</td><td></td></tr><tr><td>ピルバットナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR 遠心分離機</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 75004521</td><td></td></tr><tr><td>滅菌セルストレーナー、40 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-201-430</td><td></td></tr> 滅菌<tr><td>保存ボトル、500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

腸内調節制御t細胞誘導の生体内増強

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GUT)における炎症性慢性疾患である。米国では、約140万人のIBD患者がいます。腸内細菌に対する調節不全の免疫応答が疾患を開始し、粘膜上皮障壁を破壊することは一般に受け入れられている。我々は最近、腸内調節T(Treg)細胞がIBDに対する有望な治療法であることを示した。したがって、この記事では、腸内ホーミングTreg細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、2つの分子deノボ、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)の局所的に高濃度を産生するように設計される。我々は、1,25(OH)2Dが調節分子(例えば、フォークヘッドボックスP3およびインターロイキン-10)の発現を誘導し、RAがT細胞における腸内受容体の発現を刺激できることを示す以前の知見に基づいて1,25(OH)2DおよびRAを選択した。このような工学的樹状細胞を生成するために、レンチウイルスベクターを使用して樹状細胞を伝調し、2つの遺伝子を過剰発現させます。1つの遺伝子は、25−ヒドロキシビタミンD1α−ヒドロキシラーゼをコードするシトクロムP450ファミリー27サブファミリーBメンバー1であり、これは1,25(OH)2Dの合成を生理学的に触媒する。他の遺伝子は、レチナルアルデヒドデヒドロゲナーゼ2をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA2であり、RAの合成を生理学的に触媒する。このプロトコルは、生体内の腸ホーミングTreg細胞の将来の調査に使用することができます。

DC-CYP-ALDH細胞は、1α-ヒドロキシラーゼの有意に増加量を発現した。BMdCsから生成されたDC-CYP-ALDH細胞が1α-ヒドロキシラーゼの有意な増加量を発現したかどうかを判断するために、BMCCをレンズCYP-ALDHウイルスで形質転換し、骨髄由来DC-CYP-ALDH細胞(BMDC-CYP-ALDH細胞)を産生した。続いて、BMDC-CYP-ALDH細胞をFACSによる1α-ヒドロキシラーゼの発現について調べた。我々のデータは、BMDC-CYP-ALDH細胞を、親BMDCと比較した場合、1α−ヒドロキシラーゼの増強発現を示した(図1A)。また、BMDC-CYP-ALDH細胞における1α-ヒドロキシラーゼの酵素活性を決定した。これを行うために、CM-10-R細胞培養培地の2mL中の1.0x106 BMDC-CYP-ALDH細胞を12ウェル培養プレートに添加した。25(OH)Dを2.5μMの最終濃度で細胞培養に添加した。細胞を37°Cで培養し、24時間5%CO2</...

ここでは、腸内ホーミング調節T細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)de novoの高濃度を局所的に産生するように設計される。

腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

このプロトコルは、ヒト用途に対して容易に修飾できる潜在的に新しい治療戦略を記述する。この技術は、末梢リンパ組織における腸ホーミング調節T細胞の誘導を直接増強し、高炎症性環境においても安定的に実施することができる。これらの技術は、末梢免疫系における活性ビタミンDおよびビタミンAの役割を調べるためにも使用することができる。この視覚的なデモンストレーションでは、この技術の成功に不可欠な高品質の設計樹状細胞の生成のためのステップバイステップの手順を提供します。CM-10-D細胞培養培地中の7個の293T細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素で24時間培養する25ミリメートル培養プレートで1回10〜7回播種することから始めます。翌日、調製したての2倍の濃縮HBS溶液1.62ミリリットル、エンベローププラスミド9.5マイクログラム、包装プラスミド17.5マイクログラム、LENTI-CYP-ALDHプラスミド27マイクログラムを50ミリリットルの円錐チューブに加えます。チューブ内容物の最終容積は、水で最大3.0375ミリリットル、続いて202.5マイクロリットルの塩化モル酸モル酸モルカルシウムを添加します。DNA沈殿混合物を室温で20分間放置し、時折混合してから、293T培養ごとに3.24ミリリットルの溶液を滴下し、皿を穏やかに渦巻きます。各プレートをPBSで静かに洗浄し、CM-4-D培養培地で細胞を供給する前に、プレートをインキュベーターに24時間置きます。さらに24時間培養した後、上澄み物を摂氏4〜8度で貯蔵するために滅菌ボトルに収穫し、さらに24時間新鮮なCM-4-D培地で細胞を供給する。4日目に、再び上清を収穫し、3日と4日目の両方から上清を0.45マイクロメートルフィルターにひずみます。次いで、VSV-G擬似型ウイルスを遠心分離により24時間濃縮する。翌日、上清をデカントします。チューブを無菌バイオセーフティキャビネットのペーパータオルで数分間排出させ、培養皿あたり5%グリセロールを含む滅菌PBSの33.3マイクロリットルでペレットを再懸濁させます。骨髄由来樹状細胞生成のために、BALB/cマウスから採取したチビアスおよび大腿骨を、新鮮な培養培地を含む100x20ミリメートルの培養皿に入れる。骨から組織を取り除くためにはさみや鉗子を解剖してください。すべての骨が洗浄されたら、はさみを使用して各骨の両端を切断して骨髄腔を露出します。30ゲージの針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、各骨を10ミリリットルの新鮮な培養培地で洗い流し、骨髄を15ミリリットルのチューブに集めます。骨髄の全てが採取されると、遠心分離によって骨髄を沈下し、2ミリリットルの赤血球リシスバッファーでペレットを再懸濁する。時折揺れで室温で4〜5分後、10ミリリットルの細胞培養培地で反応を停止

in-vivo-augmentation-of-gut-homing-regulatory-t-cell-induction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

競争力のあるホーミングの実験は、直接、単一のマウスの2つの異なる細胞集団の遊走特性を評価することができます。ここでは、生体外で生成された腸管指向性と非腸熱帯T細胞の遊走を比較することによって、この手順を示しています。...

腸管指向性T細胞の移動を研究するために競争力のあるホーミングアッセイ

マウス骨髄移植は、ヒトにおいて、移植片対宿主病を支配する免疫のメカニズムを研究するために広く使われているテクニックです。...

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

我々は、単一のヒトの血液ドナーからの規制は、メモリとナイーブT細胞を生成する方法を説明します。偏Tregsのは、その後もここで詳述抑制アッセイを含む遺伝的均一性を持つ遺伝子や機能のさまざまなアプリケーション内の他のサブセットと比較することができます。...

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

人工多能性幹（iPS）細胞からTリンパ球の生成は、T細胞ベースの免疫療法のために胚性幹細胞を使用する代替アプローチを提供します。メソッドは、どちらを利用することによってことを示しています...

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ここでは、同系CD4+CD45RB高T細胞をT細胞およびB細胞欠損レシピエントに養子として移すことにより、マウスに結腸炎症を誘発するプロトコールを提示します。臨床的および組織病理学的特徴は、ヒトの炎症性腸疾患を模倣しています。この方法により、結腸性炎症の開始と疾患の進行の研究が可能になります。...

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

ここでは、マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の免疫療法のために、人工多能性幹細胞(iPSC)から機能的な抗原(Ag)特異的制御性T細胞(Tregs)を開発する方法を紹介します。...

自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発

このプロトコルは、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から人為的な制御性T細胞（iTregs）の再現性の生成と表現型を説明しています。 Foxp3誘発のための異なるプロトコルは、それぞれのプロトコルを用いて得られた特定のiTregの表現型の研究を可能にします。...

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

ここでは、モデル腫瘍抗原に対する細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 応答における immunodominance...

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

このプロトコールでは、腸内微生物叢抗原特異的T細胞養子移入大腸炎モデルが記載されている。CD4+ T細胞は、CBir1...

免疫不全マウスへのCBir1 TCRトランスジェニックCD4+ T細胞の養子移入による腸管炎症の誘導

このプロトコルは、転写因子PU.1、IRF8、およびBATF3の強制発現を通じて、腫瘍微小環境内のマウスがん細胞を1型樹状細胞にin vivo...

腫瘍細胞の1型従来の樹状細胞様細胞への扱い可能な in vivo 再プログラミング

学ぶ腸内調節制御T細胞誘導法。樹状細胞を用いて炎症環境下でも安定した免疫寛容誘導を実現し、活性型ビタミンDとAの免疫調節メカニズムを解明する革新的治療戦略です。

腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強

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