肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス
March 14th, 2020
このプロトコルは、マウスから実行可能な精密カット肝スライスを製造するための簡単で信頼性の高い方法を提供します。このエクスビボ組織サンプルは、ラボ組織培養条件下で複数回維持することができ、肝臓病理生物学を調べる柔軟なモデルを提供する。
このビデオは、肝臓組織生物学の実験的なex vivoモデルとしての精密カット肝臓スライスの生産と応用を示しています。精密カットの肝臓スライスは、生体内動物実験とインビトロ細胞培養法の間に存在する実験的ニッチを占めています。この技術は、同じ肝臓からの制御および治療サンプルを使用する能力、肝臓組織の単離によって他の臓器系からの標的外効果を除去する能力、および生きているマウス全体に適用された場合に悪影響を及ぼす可能性のある試薬を使用する能力、例えば毒性経路阻害剤など、生体内動物研究におけるいくつかの重要な利点を有する。
この技術は、横振動ブレードを使用して、生存可能な肝臓組織の超薄い肝臓スライスを切断し、続いて実験室組織培養を行うことを含む。刃の振動はせん断の圧力によって引き裂くことを防ぐ。この例では、生き生きとしたエビボ肝スライスの調製方法を示し、このex vivo組織を胆汁酸で処理して胆汁性肝損傷を刺激して肝線維形成のメカニズムを評価する実験例で肝臓スライス培養の有用性を示す。
刃を切断アームに挿入します。刃と切断アームを70%エタノール溶液で消毒します。ブレードとの接触を避けるように常に注意してください。
70%エタノール溶液でバッファートレイを消毒し、滅菌組織で拭きます。バッファートレイをビブラートメに挿入し、取り付けネジを締めます。切断アームを最大の高さに設定します。
ブレードの角度を確認します。ビブラートオームでは、水平から10度の角度を使用し、ブレードはサンプルに向かって傾斜しています。ブレードの角度がしっかりと固定されていることを確認します。
検体ホルダーを消毒し、再び、70%エタノール溶液で。バッファートレイの下にあるペルチェ熱電冷却器の冷却水を接続します。ビブラートメモデルの中には、冷却用の氷浴を使用するものもあります。
水管を排水管に固定し、水をオンにします。クーラーを摂氏4度に設定します。冷たいクレブス-ヘンセレイトバッファーをバッファートレイに追加します。
すべての手術器具および材料は無菌でなければなりません。マウスは深く麻酔または安楽死させるべきです。マウス上の皮膚表面は70%エタノール溶液で湿潤することにより、解毒した。
腹腔の基部から横隔膜まで、皮膚に中線切開を行います。きれいな鉗子とはさみを使用して、腹腔を開きます。葉を傷つけることなく、肝臓を素早く取り除きます。
肝臓を下に押し、肝臓の上部にある結合組織を切断します。肝臓を上に押します。鉗子で肝臓の中央血管領域を保持し、上方に引っ張ります.
結合組織の血管を切断します。肝臓の葉に損傷を与えないように注意し、また、胃腸管に切り込まないように注意してください。取り出した肝臓を氷冷クレブス-ヘンセレイトバッファーの無菌皿に入れます。
肝臓を個々の葉に分ける。1つの肝臓葉を選択し、新しい滅菌皿の上に平らな側面を置きます。クレブス・ヘンセレイトバッファーの氷の上に他のローブを保管します。
肝臓の葉の縁をトリミングします。トリミングは、切断刃に対して比較的垂直な組織エッジを有するように、切断刃を最初に接触させる縁部において特に重要であり、浅い角度で起こり得る組織の圧縮を防ぐ。他の3つの縁の周りの組織を切断すると、組織エッジで繊維状のカプセルの多くを取り除き、通常は組織スライスをより簡単に除去することができます。
シアノアクリル酸接着剤の薄い層を標本ホルダーの前端に置き、トリミングされた肝臓葉よりもわずかに大きくする。滅菌吸収物質を使用して組織から緩衝液の任意の残留物を除去する。シアノアクリル酸接着剤の上に肝臓の葉を置き、最大のエッジを前面に向けて配置します。
空気中で1〜2分間治癒させます。標本ホルダーに取り付けられた組織をビブラートメに入れる。ビブラートの速度を設定します。
切断ブレードを下げて、肝臓の葉のすぐ上に位置します。振動する切断アームをサンプルの上に実行します。この機械の刃の振動はフィートのペダルによって作動する。
ブレードを後方に戻し、ブレードの高さを 250 マイクロメートル下げます。組織の最上層が取り除かれるまで、このプロセスを繰り返します。これらはグリソンのカプセルを含むので、最初の1つまたは2つのスライスを捨てるので、あまり機能的な肝臓組織が含まれていません。
肝臓のスライスを切断するには、ハンドルを回すことによってゆっくりと振動ブレードを組織に進めます。小さなペイントブラシを使用して、切断プロセス中に組織を優しく導きます。ペイントブラシを使用して切断された組織セクションを拾い、保管のためにクレブス・ヘンセレイトバッファーを含む滅菌チューブに組織セクションを入れます。
使用しない場合は、氷の上にこのチューブを保管してください。いくつかの時間は、組織が切断プロセス中に裂け目を行いますが、ほとんどの目的のために、組織はまだ使用できます。シアノクリレート接着剤の近くまで組織スライスを切ります。
接着剤に切り込むな。必要な数の組織スライスが得られるまで、氷の上に座っている他の肝臓葉と一緒に繰り返します。検体ホルダを洗浄するには、ブレードを使用して接着剤と組織の混合物を削り取るか、または混合物をアセトンまたはジメチルスルホキシドなどの溶媒を使用して軟化させることができる。
組織培養フードでは、10%のウシ胎児血清と抗菌剤を12ウェルプレートに含むウィリアムズE培地のピペット1mLを12ウェルプレートに入す。混合物をそっと渦巻いて組織スライスを取り除き、無菌皿にチップを入れます。組織をほぼ均一なサイズに切ります。
この例では、50ミリメートル平方メートル前後の表面積を有する組織スライスを目指した。一貫性のために組織のスライスを調べるのに注意してください。暗いスライスは、組織の厚さが増加していることを示唆し、廃棄する必要があります。
軽いスライスは、硬化シアノクリレート接着剤の存在を示唆し、廃棄する必要があります。1ミリリットルの培地を含む12ウェルプレートに組織スライスを移します。正常な組織培養条件下で肝臓スライスをインキュベートする。
可能であれば、組織スライスへの酸素の可用性を高める方法を使用します。翌日、吸引による組織の損失を防ぐために手動ピペットを使用して培地を交換する。精密カットの肝臓スライスは、実験的な使用の準備が整いました。
我々のアプリケーションでは、2日間胆汁酸で肝臓スライスを処理し、メッセンジャーRNA抽出およびqPCR分析のためにリシス緩衝液で均質化しました。時間の経過に応じて精密カットされた肝臓スライスの生存率を調べるために、細胞生存率の代理としてATPレベルを使用しました。ATPレベルをタンパク質に正規化し、分離後の複数の時点で測定した。
ATPレベルは、即時および1時間のサンプルで減少したが、これは3時間回復した。その後、ATPレベルは5日間維持されましたが、時間の経過とともに下降傾向にあります。H&E染色は、培養で最長5日間維持された精密カット肝スライスを調べるために使用された。
組織形態は、2日目に発生するいくつかの壊死を示唆し、5日目までに重度の壊死が起こった。壊死は2日目から5日目の間に起こっているので、この技術の実験的有用性は約3日に制限することをお勧めします。しかし、これは組織スライスに対するより良い酸素送達技術を使用することによって増強することができる。
精密カットの肝臓スライスは、培養時間に対してコラーゲン繊維の肥厚を有するようにも見える。これは、発生する自発的な線維形成過程の示唆である。実験例では、精密カットされた肝臓スライスを3つの別々の胆汁酸で2日間処理し、肝胆汁胆汁を模倣した。
3つの胆管球特異的遺伝子のmRNA発現を見ると、コンジュゲート胆汁酸、グリコチル酸およびタウロコリン酸の2種は、サイトケラチン-19およびコネキシン-43の両方の発現を有意に増加させた。これは、胆管球の開発と一致しています.このビデオを見た後、あなたは精密カット肝臓スライスを作成する方法、および基本的な組織培養を行う方法をよく理解する必要があります。
精密カットの肝スライスは、RNA発現、タンパク質発現、エピジェネティクス、DNA結合、代謝、感染メカニズム、がん侵入、薬理学、細胞生物学、分泌研究などの非常に幅広い用途に使用できます。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
このプロトコルは、マウスから生存可能な精密切片肝臓スライスを作り出すための信頼性の高い方法を提供し、肝臓の病態生物学の検査を可能にします。この組織サンプルは、実験室条件下で数日間維持することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 肝臓病態生物学
背景
- 精密切片肝臓スライスは、in vivoとin vitro研究の間の実験モデルとして機能します。
- この技術により、同じ肝臓からの対照および処理サンプルを使用することができます。
- 肝臓組織を分離して、他の器官系からのオフターゲット効果を最小限に抑えます。
- 生きたマウス全体には有害な試薬を安全に適用することができます。
研究の目的
- 生存可能なex vivo肝臓スライスの生産を実証する。
- 肝線維形成のメカニズムを評価する。
- 胆汁酸を用いて胆汁うっ滞性肝臓障害を評価する。
使用される方法
- 超薄肝臓スライスを切断するための横振動ブレードの使用。
- 肝臓スライスの生存性を維持するための組織培養。
- 肝臓障害を刺激するための胆汁酸の適用。
- 肝線維形成メカニズムの評価。
主要な結果
- 生存可能な精密切片肝臓スライスの成功的な生産。
- 実験設定における肝臓スライス培養の実用性の実証。
- 胆汁うっ滞性肝臓障害メカニズムへの洞察。
- 毒性経路阻害剤の影響の評価。
結論
- 精密切片肝臓スライスは肝臓研究の価値あるモデルです。
- この方法は肝臓病態生物学の理解を深めます。
- 将来の実験研究のための柔軟なプラットフォームを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precision-cut liver slices bridge the gap between in vivo animal models and in vitro cell cultures, offering a physiologically relevant ex vivo system for mechanistic liver studies. This approach enables biopharma R&D teams to de-risk target validation by isolating hepatic responses from systemic confounders, improving predictive confidence in early discovery. The model supports iterative compound testing with reduced animal use, aligning with 3Rs principles while maintaining tissue-level complexity for fibrosis and cholestasis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a multicellular hepatic microenvironment that preserves cell-cell interactions and extracellular matrix architecture.
- Operational Value: Allows parallel control and treatment comparisons from the same liver donor, reducing biological variability and increasing statistical power in target engagement studies.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by assessing pathway-specific responses to toxic inhibitors or bile acid-induced injury without whole-animal toxicity limitations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for quantifying fibrogenic markers such as collagen deposition and cytokeratin-19 expression following cholestatic injury.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through consistent slice viability (up to three days under optimized conditions) and uniform size selection for reliable compound screening.
- Scientific Value: Enables dose-response analysis of profibrotic compounds using qPCR readouts of cholangiocyte activation markers like connexin-43.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human-relevant cholestatic liver injury mechanisms, allowing preclinical evaluation of antifibrotic compounds in a disease-contextualized system.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating mRNA expression changes (e.g., CK-19, Cx43) with histopathological signs of early fibrogenesis.
- Scientific Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that modulate spontaneous collagen thickening or bile acid-driven epithelial activation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a human-relevant ex vivo system to assess liver-specific pharmacology and toxicity before committing to in vivo studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of fibrogenic pathways by enabling direct measurement of mRNA and protein expression changes in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexable readouts (e.g., ATP-based viability, gene expression) that allow side-by-side comparison of compound effects on hepatic health.
- Analytics: Generates normalized, reproducible data (e.g., ATP/protein ratios, qPCR Ct values) suitable for cross-functional comparison between discovery and toxicology teams.
- Translational Research: Connects early mechanism discovery to preclinical continuity by modeling bile acid-induced injury, a key driver in human cholestatic liver disease progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable hepatic platform applicable across multiple projects studying metabolism, infection, cancer invasion, and secretion, maximizing ROI on tissue preparation expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through isolated liver tissue analysis.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via standardized slicing protocols and culture conditions, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing early human-relevant efficacy and toxicity signals, reducing late-stage attrition due to liver-related adverse events.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on hepatic liability profiles, optimizing capital allocation across discovery portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, vibratome operation, and sterile tissue culture techniques to ensure slice viability and reproducibility.
- Dependence on precision instrumentation (vibratome, temperature control) and sterile supplies (cyanoacrylate glue, Krebs-Henseleit buffer) for consistent slice preparation.
- Necessitates cross-team standardization of slice thickness, viability assessment (e.g., ATP levels), and injury induction protocols (e.g., bile acid concentration, duration) for reliable data sharing.
- Adaptation considerations include optimizing oxygen delivery methods to extend slice viability beyond three days for longer-term fibrosis or regeneration studies.
- Practical limitations include gradual decline in tissue function and spontaneous collagen thickening over culture duration, recommending experimental use within 72 hours for injury modeling.
