脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部

このプロトコルは、集束超音波血液脳関門(BBB)の開口部、結果として生じる遺伝子発現の評価、および組織学的検査による化学遺伝学的受容体の神経調節活性の測定による遺伝子送達に必要なステップを描写します。

当社のプロトコルは、マウスの集束超音波のサブミリメートル精度のターゲティングを可能にします。これにより、手術やMRI対応の超音波装置を使用せずに、安価な3Dプリント部品を使用して超音波の標的を絞ることができます。集束超音波血液脳関門の開口部は、最初はかなり難しい場合があります。

トランスデューサーが脱気されたゲルまたは水を使用して動物に適切に結合されていること、および注入中にマイクロバブルが崩壊しないことが重要です。その手順を実演するのは、カリフォルニア工科大学の大学院生であるリチャード・リーです。麻酔をかけたマウスでペダル反射に対する反応の欠如を確認した後、ヘパリン化生理食塩水1ミリリットルあたり10単位を使用して、きれいな25〜35ゲージのカテーテルを洗浄し、エタノールパッドを使用して動物の尾を消毒します。

カテーテルを側尾静脈に挿入し、組織接着剤を使用してカテーテルを所定の位置に固定します。針が正しく配置されている場合、カテーテル内の血液の逆流が観察されます。接着剤が乾いたら、脱毛クリームで動物の頭の毛を取り除き、マウスを3DプリントされたMRIキャリッジに入れ、前歯を鼻円錐の内側にあるバイトバーに取り付けます。

鈍いバーを安全な量の圧力で頭蓋骨に固定し、呼吸を30秒間観察して、動物が1秒間に1回の呼吸の速度で自由に呼吸していることを確認します。ターゲティングガイドをイヤーバーに接続し、呼吸を再度確認します。MRIキャリッジをMRIホルダーに入れ、ホルダーを磁石の穴の中に置きます。

次に、MRIシーケンスを取得してスキャナー内のマウスの位置を特定し、3D高速ローアングルショットシーケンスを使用して脳全体をイメージングします。MRIガイドによるターゲティングを行うには、キャリッジを脳定位固定装置内に置き、金属ブロックと両面テープを使用して、ブロックを脳定位固定装置の2つの支持ポストに固定します。MRI画像を集束超音波ガイダンスソフトウェアプログラムを実行しているコンピューターに転送し、画像を開きます。

すべての画像が読み込まれたら、右クリックして [再フォーマット] をクリックし、画像を 3 つの軸に再フォーマットします。右クリックして、探触子を円形の照準ガイドに位置合わせします。矢状図で、仮想トランスデューサの垂直位置を調整して、ウォーターバスとトランスデューサハウジングの厚さを考慮します。

軌道プランナーでターゲットとする領域を指定し、スプレッドシートに座標をメモします。目的のターゲット深度をダイヤルインし、前に示したように座標をメモします。次に、[軌道を送信して実行] をクリックし、各ポイントをターゲットにします。

MRIの座標を脳定位固定装置フレームと相関させるには、カスタムマウントされたトランスデューサーをターゲティングガイドの上に置き、3つのターゲティングボルトのそれぞれがトランスデューサーホルダーとターゲティングガイドの両方を通過できるようになるまで平行移動します。ボルトに張力がかかっていないか、傾いていないことを確認し、MRIで照準ガイドの中心が現れる点に探触子が配置されるまで、探触子を前後方向に10.56mm前方に移動します。次に、仮想トランスデューサの中心からターゲット領域までの距離を求め、フレームを使用してトランスデューサをこれらの座標に移動します。

注射液を調製するには、800マイクロリットルの生理食塩水と100マイクロリットルのMRI造影剤を1.5ミリリットルのチューブに混合してロードします。次に、非活性化マイクロバブル溶液を室温に戻してから、マイクロバブル活性化装置でマイクロバブルを45秒間活性化します。活性化後、溶液の中央から100マイクロリットルのマイクロバブルを21ゲージの針を備えた1ミリリットルのツベルクリン注射器にゆっくりとロードし、造影剤溶液に80マイクロリットルのマイクロバブルを追加します。

浮遊選鉱を避けるために、1.5ミリリットルのチューブを15秒間静かに反転させて、調製した溶液を混合します。混合の最後に、針のないシリンジに200マイクロリットルのマイクロバブル溶液をロードし、シリンジを反転させます。プランジャーを押し下げて引っ込め、30ゲージの針をシリンジに逆さまにしながら混合して取り付けます。

次に、針の端に液滴が現れるまで、マイクロバブル溶液をゆっくりと押し出します。マイクロバブルの準備ができたらすぐに、インソネーションのパルス幅を10ミリ秒に設定し、毎秒120回の繰り返しを行い、頭蓋骨に0.3〜0.45メガパスカルの圧力をかけます。ターゲティングガイドを取り外し、気泡を避けながら、脱気した超音波ゲルをマウスの頭部に塗布します。

トランスデューサーをイヤーバーホルダーの平らな部分に直接配置するまで下げ、座標を定位固定装置にダイヤルします。目的のアデノ随伴ウイルスを体重濃度1グラム当たりの10〜10分の10の0.5〜2倍に希釈し、30ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器にウイルス粒子を装填する。溶液を尾静脈カテーテルに注入し、80マイクロリットルのマイクロバブル溶液をマウスに注入します。

MRIで血液脳関門の開口部を評価するには、示されているように高速ローアングルショットシーケンスを記録します。DREADD刺激の場合、クロザピンN-オキシドを滅菌生理食塩水に1ミリグラム/ミリリットルの濃度で溶解し、腹腔内に注入します。.分娩後15〜45分で、動物の行動活動の記録を開始します。

ニューロンの活性化解析には、脳組織を使用します。実証されたプロトコルに従って、海馬領域および脳の他の部分でT1信号増強を達成することができます。観察されたように、mCherryに対する免疫染色は、DREADD発現のより信頼性の高い検出につながります この手順では、マイクロバブルを優しく取り扱い、MRIイメージングおよびインソネーション中に動物が安定していることを確認することを忘れないでください。