Name: 脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ集束超音波による血液脳関門開口と化学遺伝学的神経調節評価法。マウスを用いた非侵襲的遺伝子導入とDREADD発現解析により、神経機構の研究と神経疾患治療への応用可能性を示す。

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この研究は、Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Awardの支援を受けた。いくつかの3Dプリントされたコンポーネントは、もともとファビアン・ラビュソー(画像誘導療法、フランス)によって設計されました。著者は、原稿の準備に技術的な支援をしてくれたジョン・ヒース(カリフォルニア工科大学)とマーガレット・スウィフト(カリフォルニア工科大学)に感謝します。

利益相反はありません。

ATACでは、正確なMRIガイド下ターゲティング、FUS-BBBO、遺伝子発現の組織学的評価など、特定の神経回路の神経調節を成功させるためのいくつかの技術の実装を成功させる必要があります。3Dプリント可能なコンポーネントは、イメージング誘導FUS-BBBOで小さな脳構造のターゲティングを簡素化するために開発されました。
MRIガイド下集束超音波(MRIgFUS)投与は、多くの課題をもたらします。まず、一般的なMRIコイルは、超音波ハードウェアではなく標本のみを収容するように設計された限られたスペースを持っています。MRIのより大きなボアは、信号がコイル32のフィルファクタに関連するので、機器のコストを増加させ、画質を低下させる。その結果、MRIで動物の画像の上部に配置されたFUSハードウェアは、画像品質を低下させます。第二に、MRI対応デバイスの設計は困難で費用がかかります。MRI対応材料は、反磁性であり、高周波照射時に渦電流が発生する傾向が低く、高磁場での磁化率が低い必要があります。導電性材料では、渦電流の発生またはその磁化率も画像品質に悪影響を及ぼします。最後に、利用可能なMRI互換材料は、固定装置フレームなどの精密ターゲティングマシンの製造に通常使用される金属よりもヤング率と耐久性が低くなっています。位置調整に使用されるモーターは、MRIに対応し、そのサイズのためにMRIボアの外側に配置する必要があります。これらのモーターは、MRI互換材料を使用して、MRIボア内のトランスデューサーに距離を置いて接続する必要があります。塑性反りの問題、堅牢なサイズのコンポーネントを実装するためのボア内の十分なスペースの欠如、および脳全体のターゲティング位置を変更するための不十分な余地が、以前の研究のターゲティング精度に影響を与えました。
これらの問題を解決するために、MRIでのイメージングとスキャナー外でのFUS-BBBO投与を行うことを決定しました。MRIガイダンスを可能にするために、マウスは、MRIとステレオタックス座標空間の両方でマウスの脳構造を局在化するために使用できるMRI可視ターゲティングガイドを備えた3Dプリントされた拘束具内に配置されました。マウスの頭蓋骨とターゲティングガイドの両方がイヤーバーホルダーにしっかりと取り付けられているため(図1a、b)、ターゲティングガイドを使用してMRI画像内の空間座標を相関させ、定位固定装置をゼロにすることができます。拘束装置には可動部品がなく、トランスデューサも含まれていないため、MRI内に収まる堅牢性と小型化を実現し、トランスデューサの電子機器からの信号干渉を排除しました。一部の材料の3DプリントされたサポートがMRIに表示されるため、ターゲティングガイド内のスペースはくり抜かれています(図1c)。定位固定装置キャリブレーションを可能にするために、アセンブリに穴が導入されました(図3)。超音波トランスデューサをステレオタックスの電極ホルダーに取り付け、セクション4(図1d)で説明したようにターゲティングを実行しました。トランスデューサーは、レベルプレーンからの逸脱を防ぐために、イヤーバーのハウジングによってその長さに沿って支持されるべきです。背腹方向のターゲティングは、環状アレイの位相シフトを使用して達成できます。
実用的なターゲティング精度は、超音波フォーカシングと頭蓋骨の減衰によって決まります。FUS−BBBO手順は、ラット11について詳細に記載されており、他の多くのモデル生物23、33、34およびヒト16、17において実施されている。超音波の焦点サイズの関係は周波数に反比例し、周波数が高いほどより正確な送達が可能になります。ただし、頭蓋骨の減衰は周波数35で増加し、頭蓋骨の加熱と皮質領域の損傷につながる可能性があります。正確なターゲティング戦略は、脳の部位によって異なります。全幅半最大圧力が脳組織内に収まる部位は、線条体、中脳、海馬などの多くの脳構造において予測可能で安全なBBB開口部を可能にする。脳の基部近くの領域は、マウスに特定の課題をもたらします。マウスの脳は背腹方向に約8〜10mmの大きさで、これは多くの市販のトランスデューサーの全幅半値サイズに匹敵します。その結果、頭蓋骨の底部を標的にすることは、外耳道、口、または気管に存在する骨および空気からの超音波反射をもたらし、高圧および低圧の予測不可能なパターンをもたらし得る36。これらの圧力のいくつかは、出血および組織損傷を引き起こすことが示されている慣性キャビテーション閾値を超える可能性がある37。頭蓋骨の基部近くに位置する領域を標的とするために、交差遺伝学38が、FUSビームで標的とされる領域よりも小さい領域に遺伝子発現を制限するために使用される交差ATAC7を使用することが好ましい場合がある。交差ATACの公表された例では、ドーパミン作動性細胞において遺伝子編集酵素(Cre38)を発現するトランスジェニック動物が、ドーパミン作動性細胞を含む領域のサブセクションにおいて超音波で標的化されている。最後に、皮質領域をFUSで標的にすることができますが、超音波の回折と反射が発生し、不均一な圧力プロファイルにつながる可能性があります。このプロトコルは、使用される種に大きく依存するため、皮質領域の標的化をカバーしていません。しかしながら、海馬7の上の皮質のいくらかの標的化(例えば、図7)が観察されており、少なくともマウスにおいて、可能であることを示す。
化学遺伝学的活性化剤の選択および投与量は、特定の実験的ニーズに依存する。著者の研究7の1つを含む多くの研究は、有意な非特異的反応を示さなかったが39,40、高用量(例えば、10 mg / kg)は、少なくとも場合によっては副作用を引き起こす可能性があります41。しかしながら、全ての行動実験と同様に、CNOおよびその代謝産物42の潜在的なオフターゲット活性のために、適切な対照31が不可欠である。このような対照には、DREADDを発現する動物へのCNOおよび生理食塩水対照の投与、および野生型動物へのCNOの投与、または特定の場合には、それぞれ化学遺伝学的受容体を発現する脳の同側部位と対側部位の比較が含まれます。さらに、最近の研究では、特異性が向上した多くの新しいDREADDアゴニストが明らかになりました28,29,43。他の化学遺伝学的受容体5、25、44もATAC手順と併せて使用することができる。
遺伝子発現の組織学的評価は、すべての動物について死後必要です。ごく一部の動物は、FUS-BBBO7後に遺伝子発現不良を示します。また、ミスターゲティングが可能なため、遺伝子発現の空間的精度や特異性を示す必要があります。注目すべきことに、一部のAAVは逆行性または順行性のトレース能力を示す可能性があり45 、正確な超音波ターゲティングにもかかわらず、超音波の標的部位から遠く離れたトランスフェクションを引き起こす可能性があります。発現された化学遺伝学的受容体がフルオロフォアに融合または共発現する場合、組織切片におけるフルオロフォアのイメージングは、局在および発現強度を評価するのに十分であり得る。しかし、多くの蛍光タンパク質は組織固定プロセスによって損傷を受けており、DREADDで頻繁に使用されるmCherryタンパク質の免疫染色は、以前の研究でより良いシグナルをもたらしました7。最後に、脳の特定の部分(海馬の顆粒状細胞層など)のニューロンの密度により、融合とは対照的に、IRES下で発現された核局在蛍光団を使用して細胞カウントを行うことは、核を容易にセグメント化し、DAPIやTO-PRO-3などの核染色で対比染色できるため、有益である可能性があります。c-Fos染色による神経調節を評価するには、核対比染色を行い、蛍光シグナルではなくc-Fos陽性核をカウントすることが不可欠です。場合によっては、細胞の破片が蛍光を示し、陽性細胞の測定値を混乱させる可能性があります。
FUS-BBBOによる薬物および遺伝子送達の限界には、侵襲的頭蓋内注射による送達よりも分解能が低いこと、および大量の注射薬物またはウイルスベクターが必要であることが含まれる。さらに、脳への直接注射は注射部位への排他的送達をもたらすが、FUS-BBBOは静脈内経路を使用するため、末梢組織への送達が可能である。神経調節のために化学遺伝学を使用することの制限には、遅いタイムスケールが含まれ、これは神経調節の強度の急速な変化を必要とするいくつかの行動プロトコルには不十分である可能性がある。

光遺伝学1,2や化学遺伝学3,4,5などの回路特異的な神経調節技術の使用は、神経回路障害としての精神状態についての理解を深めました。神経回路は、通常、特定の細胞型、脳領域、分子シグナル伝達経路、および活性化のタイミングによって定義されるため、研究が難しく、脳障害の治療において制御がさらに困難です。理想的には、研究と臨床アプリケーションの両方にとって、そのような制御は非侵襲的に発揮されますが、正確で非侵襲的な神経調節の両方を達成することは困難です。例えば、神経活性薬は非侵襲的に脳に到達することができますが、脳全体に作用することによって空間特異性を欠いています。一方、脳深部電気刺激療法は、特定の脳領域を制御することはできますが、特定の細胞型を制御することが難しく、手術とデバイスの配置が必要です6。
音響標的化学遺伝学7(ATAC)は、空間的、細胞型的、および時間的特異性を備えた神経調節を提供します。これは、空間ターゲティングのための集束超音波誘発血液脳関門開口(FUS-BBBO)、細胞型特異的プロモーターの制御下で遺伝子を非侵襲的に送達するためのアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の使用、および薬物投与を介してトランスフェクトされた神経回路を選択的に調節するための操作された化学遺伝学的受容体の3つの技術を組み合わせたものです。FUSはFDA承認の技術であり、人間の脳を含む組織の深部にミリメートルの空間精度で焦点を合わせる超音波の能力を利用しています。高出力では、FUSは本態性振戦8に対するFDA承認の治療を含む非侵襲的標的アブレーションに使用されます。FUS-BBBOは、低強度超音波と全身投与されたマイクロバブルを組み合わせて、超音波焦点で血管内で振動し、BBB9の局所的で一時的な(6-24時間)および可逆的な開口部をもたらします。この開口部は、げっ歯類10および非ヒト霊長類15において著しい組織損傷なしに、タンパク質9、10、小分子11、およびウイルスベクター7、12、13、14の脳への送達を可能にする。FUS-BBBO16,17の臨床試験が進行中であり、この技術の治療応用の可能性を示しています。
AAVを使用したウイルス遺伝子送達も、最近のFDAおよびEUの規制当局の承認が主要なマイルストーンとして、CNS疾患の臨床使用に急速に進んでいます。最後に、デザイナードラッグによって排他的に活性化されるデザイナー受容体(DREADD)などの化学遺伝学的受容体18は、トランスジェニックまたはトランスフェクトされた動物におけるニューロン興奮に対する薬理学的制御を提供するために神経科学者によって広く使用されています19,20。DREADDは、内因性リガンドではなく合成化学遺伝学的分子に応答するように遺伝子操作されたGタンパク質共役型受容体(GPCR)であり、これらのリガンドを全身投与すると、DREADD発現ニューロンの興奮性が増加または低下します。これら3つの技術をATACに組み合わせると、空間的、細胞型、時間的精度で選択された神経回路の非侵襲的変調に使用できます。
ここでは、単純な3Dプリントされたターゲティング装置を使用して、マウスのFUS-BBBOで脳領域を正確にターゲティングするための方法論を含めることにより、FUS-BBBO11 の以前に公開されたプロトコルを拡張および更新します。また、FUS-BBBOのATACへの応用についても紹介する。化学遺伝学的受容体を有するAAVの送達に必要なステップ、および組織学による遺伝子発現および神経調節の評価を示す。この技術は、遺伝子発現または神経調節のために大きなまたは複数の脳領域を標的とする場合に特に適用可能である。例えば、皮質の広い領域は、FUS-BBBOで容易に形質導入され、化学遺伝学を用いて調節され得る。しかしながら、代替技術である頭蓋内注射による遺伝子送達は、多数の侵襲的注射および開頭を必要とするであろう。FUS-BBBOとそのアプリケーションであるATACは、脳領域が大きく、侵襲的に標的とするのが難しいさまざまなサイズの動物にスケーリングできます。

<table><tbody><tr><td>21ゲージ針 (BD)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14826C</td><td></td></tr><tr><td>25ゲージバタフライカテーテル</td><td>ハーバードバイオサイエンス</td><td>725966</td><td></td></tr><tr><td>30ゲージ針 (BD)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14826F</td><td></td></tr><tr><td>吸収性ブルーパッド</td><td>オフィスデポ</td><td>902406</td><td></td></tr><tr><td>アンチ-c-Fos抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td>SC-253-G</td><td></td></tr><tr><td>抗mCherry抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>PA534974</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Biospec 70/30</td><td>ブルカー</td><td>カスタム</td><td>には、RFコイルが含まれています</td></tr><tr><td>クロザピン-n-オキシド</td><td>Tocris</td><td>4936</td><td></td></tr><tr><td>カスタム設計の3DプリントマウスハーネスとMRIgFUSターゲティングコンポーネント</td><td>ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td><td>からのカスタム</td><td>ダウンロード szablowskilab.org/downloads</td></tr><tr><td>カスタムMRIgFUSマシン</td><td>ImageGuidedTherapy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Definityマイクロバブル</td><td>Lantheus</td><td>DE4</td><td></td></tr><tr><td>脱気アクアソニック/超音波ゲル</td><td>Fisher Scientific</td><td>5067714</td><td></td></tr><tr><td>Depilation cr&egrave;me</td><td>Nair</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>8素子環状アレイ探触子</td><td>Imasonic Inc.</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>エタノールパッド/アルコール綿棒(70%) (BD)</td><td>オフィスデポ</td><td>599893</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン (10%)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバーハイドロフォン</td><td>精密音響PE10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1513314</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>524650-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Prohance造影剤</td><td>ブラッコ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>フィッシャーScientific</td><td>NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体、ロバ抗ヤギ</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体、ロバ抗ウサギ</td><td>ThermoFisher</td><td>84546</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ(ストレート)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17467480</td><td></td></tr><tr><td>ThermoGuide Software</td><td>ImageGuidedTherapy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織接着剤(グルチャー)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9855218</td><td></td></tr><tr><td>Tuberculin Syringe (1 mL) (BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>VeroClear 3D プリント可能材料</td><td>Stratasys</td><td>RGD810</td><td></td></tr><tr><td>Vialmix マイクロバブル活性化装置</td><td>Lantheus</td><td>VMIX</td><td></td></tr><tr><td>振動ミクロトーム</td><td>湿布</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

音響標的化学遺伝学(ATAC)は、特定の神経回路の非侵襲的制御を可能にします。ATACは、集束超音波(FUS)誘導血液脳関門開口(FUS-BBBO)、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子送達、および操作された化学遺伝学的タンパク質受容体およびそれらの同族リガンドによる細胞シグナル伝達の活性化の組み合わせによって、このような制御を実現します。ATACでは、単一の非侵襲的超音波アプリケーションを使用して、大脳領域と小脳領域の両方をミリメートルの精度でトランスデューシングすることが可能です。この形質導入は、後に、薬物を用いて自由に動く動物において、長期の、非侵襲的な、装置なしの神経調節を可能にすることができる。FUS-BBBO、AAV、および化学遺伝学は複数の動物で使用されてきたため、ATACは他の動物種での使用にもスケーラブルである必要があります。この論文では、以前に公開されたプロトコルを拡張し、複雑なMRI互換のFUSデバイスを必要とせずに、MRIガイダンスを使用してFUS-BBBOを使用して小さな脳領域への遺伝子送達を最適化する方法を概説します。このプロトコルでは、任意のラボで3Dプリントでき、さまざまな種やカスタム機器に合わせて簡単に変更できるマウスターゲティングおよび拘束コンポーネントの設計についても説明しています。再現性を高めるために、プロトコルでは、マイクロバブル、AAV、および静脈穿刺がATAC開発でどのように使用されたかを詳細に説明しています。最後に、ATACを利用した研究の予備調査を導くために、データの例が示されています。

ATACプロトコルを実行する最初のステップは、FUS-BBBOを所望の脳領域にターゲティングすることである。例えば、記載されたプロトコルに従って、海馬をFUS-BBBOで標的とし、造影剤およびAAV9を担持したDREADDをマウスに注射し、続いてマウスの脳の画像を取得するFLASH 3D MRIシーケンスを投与した。T1シグナルの増強は、海馬領域(図6)および脳の他の部分(図7)で達成されました。数週間後、DREADDは標的脳領域内で発現しました。多くのDREADDは蛍光レポーター(mCherryなど)に融合されていますが、ホルムアルデヒドによる灌流と固定のプロセスにより、これらのタンパク質の蛍光が大幅に減少することがわかりました。mCherryまたはDREADDに対する免疫染色は、以前の経験に基づいて、発現のより信頼性の高い検出につながりました(図8)。以前の実験では、マウスの~85%がFUS-BBBO7後に発現を示しました。DREADDの十分なレベルの発現の簡単なテストは、細胞レベルでそれらの機能をテストすることです。それは、例えば、CNO19、デスクロロクロザピン28、またはその他29などの化学発生的リガンドまたは生理食塩水コントロールを提供し、心臓灌流および固定の前に2時間待つことによって行うことができる。次に、脳切片を、ニューロンの活動が高まっていることを示すc-Fosタンパク質30とDREADDについて共免疫染色しました。DREADDを標的とした脳の部位が、生理食塩水7を投与された群と比較して、またはFUS-BBBOを受けなかった対側部位と比較して、化学遺伝学的リガンドを投与された群でc-Fos陽性のニューロン核の数が有意に多かった場合、実験は成功したと見なされました。注目すべきことに、これらのリガンドのいくつかは、DREADDの発現なしにニューロンを非特異的に活性化する可能性があります。例えば、CNOはマウスにおいて低レベルのクロザピンに代謝されることが示されており、これはBBBを通過し、高い効力でDREADDを活性化する27。しかし、非特異的な場所に結合することも示されました。すべての実験と同様に、化学遺伝学的研究にすべての適切なコントロールを含めることが重要です31。1つの可能な対照は、野生型マウスへの化学発生リガンドの投与であり、手順なしで、所望の行動学的または組織学的アッセイに対する薬物単独の効果を排除する。別の対照は、4つのグループを含めることができます:DREADD +リガンド、DREADD +ビヒクル、EGFP +リガンド、EGFP +ビヒクル、これはFUS-BBBOによる遺伝子送達と化学発生リガンドの両方の潜在的な影響を説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> 図1:ATACにおけるFUSのMRI誘導ターゲティングのプロセス。 (a)イヤーバー、ノーズコーン、MRIスキャナー内に収まるプラットフォームを備えたマウスの配置。(b)MRIで見える3Dプリントガイド(青)をイヤーバーフレームの端に取り付け、4本のスナップオンボルト(半透明の青)を含む表面MRIコイルのホルダーで所定の位置に固定しました。(c)矢状MRIでの3Dプリントされたガイドの外観(左パネル)、ガイドの下部と位置合わせされたトランスデューサーの仮想表現の下部(黄色の半円)。右パネルは、コロナビューからのMRI上の3Dプリントガイドの外観を示しています。明るい円は、MRIコントラストの強いポリジェットサポート材料でできていました。十字架はプラスチックで形成されました。黄色の円は、定位固定装置フレーム内のガイドと同心円状に位置合わせされたトランスデューサの位置を表します。(d)脳構造を標的とするために、仮想トランスデューサを、超音波コーン/ハウジングの厚さに一致するようにマウスの上のz方向に移動させた。この場合、ウォーターバスの厚さのため、正確なターゲティングのためにトランスデューサーをガイドから8.2 mm上に移動しました。MRI画像データを用いて脳の構造を選択し、そのMRI座標を書き留めて定位固定装置に入力しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> 図2:使用するソフトウェアのインターフェース。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> 図3:MRI座標空間を定位固定装置に一致させるプロセス。(a)探触子ホルダー内の3つの穴をMRIガイド内の3つの穴に位置合わせし、アセンブリ全体に屈曲を引き起こさずに3本の円錐形のターゲットボルトを挿入しました。(b)理想的には、3本のボルトすべてが穴の中心に配置されます。(c)位置合わせに不正確さがある場合、3本のボルトすべてが収まるわけではありません(たとえば、1°の小さな、おそらく知覚できないヨーの場合、反対側のボルトがMRIガイドに詰まっている間、1本のボルトだけが収まります。あるいは、ボルトが押し込まれたときにアセンブリ全体が目に見える屈曲がある可能性があります。(d)ボルト継手の拡大図。最高の精度を得るには、ボルトを同心円状に配置する必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> 図4:シリンジ内のマイクロバブルの迅速な再分布。 (a)シリンジは混合後5秒で撮影した。(b)1分後、1 mLツベルクリンシリンジの上部近くに気泡の濃縮物の一部を示すはっきりと見える層がありました。本実施例は、特に、マイクロバブルの溶液を用いた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> 図5:トランスデューサの中心をMRIガイドの中心に配置するプロセス。 (a)この論文に示すモデルでは、赤いキャリアは、 図3bに示す位置からここに示す位置に10.56mm前方に移動するように設計されています。(b)超音波処理の前に青色のMRIガイドを取り外し、超音波の通過を確実にするためにマウスとトランスデューサー(オレンジ色)の間に超音波ゲルを適用した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> 図6:BBB開口部のMRIによる可視化。(a)BBB開口部の軸方向図。矢印で示されたより明るい領域は、MRIT1 造影剤の血管外漏出を示す。(b)FUS-BBBO(矢じり)を標的とした背側海馬と海馬上の皮質の冠状図。(c)FUS-BBBOを標的とした中央海馬のコロナ状図(矢じり)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> 図7:本論文で説明した3ボルトターゲティングシステムを使用した4つの脳部位のターゲティングの例。矢じりのある領域は、MRI造影剤の拡散を伴うBBBの開口部を示した。4つのサイトは、下から上に、各BBB開口部の間に~150秒で連続してターゲットが付けられました。画像は、最後のBBBオープニングから2分以内に撮影されました。スケールバーは2mmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> 図8:DREADD発現の検出。 (a)DREADDに付着した蛍光色素の免疫染色(この場合はmCherry)は、いくつかの研究で信頼できる検出方法でした。(b)(a)と同じ条件で海馬を標的としたDREADDの別の代表的なセクションでは、mCherryの蛍光自体が強いバックグラウンドと比較的弱いシグナルを生成しました。(c)陰性対照として、AAVの全身注射を受けたが、FUS-BBBOを受けなかったマウスを使用した。mCherry免疫染色では有意な発現は見られません。スケールバーは500mmです(a、cのデータは7 から許可を得て、Copyright 2020 Nature-Springer)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、集束超音波血液脳関門(BBB)の開口部、結果として生じる遺伝子発現の評価、および組織学的検査による化学遺伝学的受容体の神経調節活性の測定による遺伝子送達に必要なステップを描写します。

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

当社のプロトコルは、マウスの集束超音波のサブミリメートル精度のターゲティングを可能にします。これにより、手術やMRI対応の超音波装置を使用せずに、安価な3Dプリント部品を使用して超音波の標的を絞ることができます。集束超音波血液脳関門の開口部は、最初はかなり難しい場合があります。トランスデューサーが脱気されたゲルまたは水を使用して動物に適切に結合されていること、および注入中にマイクロバブルが崩壊しないことが重要です。その手順を実演するのは、カリフォルニア工科大学の大学院生であるリチャード・リーです。麻酔をかけたマウスでペダル反射に対する反応の欠如を確認した後、ヘパリン化生理食塩水1ミリリットルあたり10単位を使用して、きれいな25〜35ゲージのカテーテルを洗浄し、エタノールパッドを使用して動物の尾を消毒します。カテーテルを側尾静脈に挿入し、組織接着剤を使用してカテーテルを所定の位置に固定します。針が正しく配置されている場合、カテーテル内の血液の逆流が観察されます。接着剤が乾いたら、脱毛クリームで動物の頭の毛を取り除き、マウスを3DプリントされたMRIキャリッジに入れ、前歯を鼻円錐の内側にあるバイトバーに取り付けます。鈍いバーを安全な量の圧力で頭蓋骨に固定し、呼吸を30秒間観察して、動物が1秒間に1回の呼吸の速度で自由に呼吸していることを確認します。ターゲティングガイドをイヤーバーに接続し、呼吸を再度確認します。MRIキャリッジをMRIホルダーに入れ、ホルダーを磁石の穴の中に置きます。次に、MRIシーケンスを取得してスキャナー内のマウスの位置を特定し、3D高速ローアングルショットシーケンスを使用して脳全体をイメージングします。MRIガイドによるターゲティングを行うには、キャリッジを脳定位固定装置内に置き、金属ブロックと両面テープを使用して、ブロックを脳定位固定装置の2つの支持ポストに固定します。MRI画像を集束超音波ガイダンスソフトウェアプログラムを実行しているコンピューターに転送し、画像を開きます。すべての画像が読み込まれたら、右クリックして [再フォーマット] をクリックし、画像を 3 つの軸に再フォーマットします。右クリックして、探触子を円形の照準ガイドに位置合わせします。矢状図で、仮想トランスデューサの垂直位置を調整して、ウォーターバスとトランスデューサハウジングの厚さを考慮します。軌道プランナーでターゲットとする領域を指定し、スプレッドシートに座標をメモします。目的のターゲット深度をダイヤルインし、前に示したように座標をメモします。次に、[軌道を送信して実行] をクリックし、各ポイントをターゲットにします。MRIの座標を脳定位固定装置フレームと相関させるには、カスタムマウントされたトランスデューサーをターゲティングガイドの上に置き、3つのターゲティングボルトのそれぞれがトランスデューサーホルダーとターゲティングガイドの両方を通過できるようになるまで平行移動します。ボルトに張力がかかっていないか、傾いていないことを確認し、MRIで照準ガイドの中心が現れる点に探触子が配置されるまで、探触子を前後方向に10.56mm前方に移動します。次に、仮想トランスデューサの中心からターゲット領域までの距離を求め、フレームを使用してトランスデューサをこれらの座標に移動します。注射液を調製するには、800マイクロリットルの生理食塩水と100マイクロリットルのMRI造影剤を1.5ミリリットルのチューブに混合してロードします。次に、非活性化マイクロバブル溶液を室温に戻してから、マイクロバブル活性化装置でマイクロバブルを45秒間活性化します。活性化後、溶液の中央から100マイクロリットルのマイクロバブルを21ゲージの針を備えた1ミリリットルのツベルクリン注射器にゆっくりとロードし、造影剤溶液に80マイクロリットルのマイクロバブルを追加します。浮遊選鉱を避けるために、1.5ミリリットルのチューブを15秒間静かに反転させて、調製した溶液を混合します。混合の最後に、針のないシリンジに200マイクロリットルのマイクロバブル溶液をロードし、シリンジを反転させます。プランジャーを押し下げて引っ込め、30ゲージの針をシリンジに逆さまにしながら混合して取り付けます。次に、針の端に液滴が現れるまで、マイクロバブル溶液をゆっくりと押し出します。マイクロバブルの準備ができたらすぐに、インソネーションのパルス幅を10ミリ秒に設定し、毎秒120回の繰り返しを行い、頭蓋骨に0.3〜0.45メガパスカルの圧力をかけます。ターゲティングガイドを取り外し、気泡を避けながら、脱気した超音波ゲルをマウスの頭部に塗布します。トランスデューサーをイヤーバーホルダーの平らな部分に直接配置するまで下げ、座標を定位固定装置にダイヤルします。目的のアデノ随伴ウイルスを体重濃度1グラム当たりの10〜10分の10の0.5〜2倍に希釈し、30ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器にウイルス粒子を装填する。溶液を尾静脈カテーテルに注入し、80マイクロリットルのマイクロバブル溶液をマウスに注入します。MRIで血液脳関門の開口部を評価するには、示されているように高速ローアングルショットシーケンスを記録します。DREADD刺激の場合、クロザピンN-オキシドを滅菌生理食塩水に1ミリグラム/ミリリットルの濃度で溶解し、腹腔内に注入します。.分娩後15〜45分で、動物の行動活動の記録を開始します。ニューロンの活性化解析には、脳組織を使用します。実証されたプロトコルに従って、海馬領域および脳の他の部分でT1信号増強を達成することができます。観察されたように、mCherryに対する免疫染色は、DREADD発現のより信頼性の高い検出につながります この手順では、マイクロバブルを優しく取り扱い、MRIイメージングおよびインソネーション中に動物が安定していることを確認することを忘れないでください。

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Neuroscience

神経科学

マイクロバブルのInsonationは減少時間平均音響パワーで、同様に治療薬の標的化送達のための腫瘍切除のための有望な戦略である。本研究の目的は、皮下C6神経膠腫への非熱的血管アブレーションとペイロードの配信を最大にするためには、低いデューティサイクルの超音波パルス化戦略とナノキャリアを開発することである。...

コントラストの超音波は、薬剤ベアリングナノ粒子デリバリーと微小血管アブレーションを経由してマウスの神経膠腫の治療を対象と

血液脳関門（BBB）のマイクロバブル媒介集束超音波の乱れは、脳の非侵襲的な標的薬物送達のための有望な技術です。...

ラットモデルでの経頭蓋集束超音波を用いた血液脳関門のMRI誘導破壊

このビデオでは、マイクロバブル媒介集束超音波(FUS)を使用して一時的な開口部を作成することにより、血液脳関門(BBB)を一時的に破壊する方法について説明しています。これらの一過性の局所BBB開口部は、最終的には、より大きなサイズの薬物分子を脳実質に直接送達するために使用できます。...

フォーカス超音波を用いたマイクロバブル媒介血液脳関門開口:超音波処理によりマウスの血液脳関門に局在性一過性開口を作製する技術

マイクロバブル剤を用いた集中超音波は、血液脳関門を局所的かつ一過性に開くことができる。この技術は、血液脳関門を越えて幅広い薬剤を送達するために使用されてきた。この記事では、MRI...

ラットモデルにおける集中超音波を用いた位置特異的血液脳関門開口へのベンチトップアプローチ

血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。...

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

ここでは、血液脳関門(BBB)を葉状またはマウス脳全体に一過性に開放して蛍光標識抗体を送達し、ミクログリアを活性化するプロトコルを紹介します。また、組織学による抗体の送達およびミクログリア活性化を検出する方法も提示される。...

集束走査超音波を用いた脳への抗体の送達

このプロトコルは、血液脳関門透過性を高めるために、焦点を合わせて超音波およびマイクロバブル治療中にげっ歯類脳の生体 内...

リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

この研究では、頸静脈カテーテル法を受けた生きたラットを利用して血液脳関門(BBB)の開口部を監視する、磁気共鳴画像法(MRI)と低強度パルス焦点式超音波(FUS)を組み合わせたプロトコルについて説明しています。...

前臨床焦点式超音波システムによるラットの血液脳関門開口部のモニタリング

技術が広くマイクロバブルと超音波を用いたマウスにおける血液脳関門を開くために記述されています。このテクニックを使用して、マンガンは、マウスの脳に投与することができる。マンガンは脱分極の神経細胞に蓄積するMRI造影剤であるため、このアプローチは、神経活動のイメージングを可能にします。...

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

本研究では神経変性条件下で血液-脳関門の破壊を評価するための簡単で効率的な手順を提案する.我々 の目的を達成するために我々 は高分子量かにラベル (FITC)...

神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

学ぶ集束超音波による血液脳関門開口と化学遺伝学的神経調節評価法。マウスを用いた非侵襲的遺伝子導入とDREADD発現解析により、神経機構の研究と神経疾患治療への応用可能性を示す。

脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部

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