消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析
September 18th, 2020
ここでは、消化管癌におけるDNAメチル化のゲノム全体解析の手順について説明する。この手順は、遺伝子のメチル化パターンと胃腸癌の発がんに寄与する因子との関係を調査する研究と関連するものである。
したがって、ヒトゲノムにおけるDNAメチル化の複雑な収差に対するLAプラットフォームによるDNAメチル化ゲノム全体の分析は、胃腸癌におけるエピジェネティックバイオマーカーの重要な情報を提供することができる。このLAプラットフォームはヒトゲノムにおけるDNAメチル化の複雑な収差を実現するが、コストとゲノムカバレッジの面で最適である。そこで、この手順を実演するのが、研究室の大学院生である百瀬博隆さんです。
まず、10マイクロメートルの未染色ホルマリン固定パラフィン埋め込みセクションを用意します。スライドをガラススライドホルダに入れ、生理的な部分で満たし、スライド上のすべての組織が水没していることを確認します。スライドを15分間キシレンに入れたままにし、スライドをピペットチップで保持しながらキシレンを注ぎ、落ちないようにします。
以前と同じレベルに多くのキシレンを注ぎ、インキュベーションを繰り返します。キシレンを注ぎ、スライドホルダーに100%エタノールを充填し、スライド上のすべての組織が完全に水没していることを確認します。スライドをエタノールに3分間放置し、エタノールを新鮮なエタノールに置き換え、さらに2分間インキュベートします。
エタノールを注ぎ、スライドを取り除きます。きれいなペーパータオルの上に慎重に顔を上げ、10分間乾燥させます。1.5ミリリットルの単独使用ポリプロピレンチューブに80マイクロリットルのリシスバッファーを充填し、きれいなピペットチップをバッファーに入れます。
適切なH&E染色部に従ってマクロ解剖に最も適した腫瘍領域の癌組織を同定し、その後、マークされたセクションに基づいて癌組織をマクロディスセプトする。きれいなカミソリの刃を取り、それを一枚に保つためにスライドから癌組織をそっと削り取ります。ピペットチップを使用して、掻き取った組織をリシスバッファーバイアルに移します。
残りのスライドでこの手順を繰り返します。すべての組織がチューブ内にある後、組織が完全に水没し、壁に貼り付けられていないことを確認するために先端を使用してください。バイアルに20マイクロリットルのスチリシン関連セリンプロテアーゼを加え、軽くフリックして混ぜます。
バイアルを55°Cのヒートブロックに少なくとも4時間または一晩置き、2時間後にわずかに渦を出すことを確認します。製造業者の指示に従ってバイサルファイト変換キットを使用して、消化された組織の45マイクロリットルにバイサルファイト処理を行います。サンプルに希釈バッファーを5マイクロリットル加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。
一方、750マイクロリットルの蒸留水と210マイクロリットルの希釈液をCT変換試薬の1本のチューブに加えて、バイサルファイト変換試薬を調製する。10分間ボルテックスでチューブを混合し、調製したCT変換試薬の100マイクロリットルを各サンプルに加え、反転によって混合します。暗闇の中で12〜16時間摂氏50度でサンプルをインキュベートします。
インキュベーションの後、サンプルを氷の上に10分間置きます。400マイクロリットルの結合バッファーを加え、上下にピペット処理して各サンプルを混合します。各サンプルをスピンカラムにロードし、カラムを2ミリリットルの回収チューブに入れる。
サンプルを全速速で1分間遠心し、フロースルーを破棄します。各カラムに200マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、1分間全速速度で回転し、フロースルーを廃棄します。各カラムに200マイクロリットルの脱スルバッファーを加え、カラムを室温で15分間放置します。
インキュベーション後、カラムをフルスピードで1分間回転させ、フロースルーを破棄します。200マイクロリットルの洗浄バッファー遠心分離機でカラムを2回、洗浄後1分間全速力で洗浄します。各カラムに46マイクロリットルの蒸留水を加え、新しい滅菌1.5ミリリットルの単独使用ポリプロピレンチューブに入れます。
DNAを溶出し、カラムを捨てるのに2分間チューブを回します。DNAは分析の準備が整いました。各遺伝子解析において、バトリューション領域のメチル化を評価するために、定量的メチル化特異的PCRのテンプレートとしてバイサルファイト改変DNAを使用します。
テキスト原稿に記載されている試薬を組み合わせ、96ウェルリアルタイムPCR装置を使用して、サーモサイクリングプロトコルを実行します。トレーニングコホートにおける胃癌患者48人の特徴をここに示す。患者の年齢の中央値は74歳で、コホートには38人の男性と10人の女性が含まれていました。
まず、外れ値の識別のために48個のサンプルがすべてロードされました。2つのサンプルは、他から変位した2つの標準偏差よりも大きいピークを与え、これらのサンプルを除去した。結果として得られたヒートマップは、高メチル化と低メチル化に基づいて2つのグループに分けられた。
このヒートマップにより、微分メチル化解析において転写開始部位の1,500塩基対内の上位50個のプローブを可視化できます。多変量解析で臨床病理学的因子を共変量として用いた場合、癌の種類およびリンパ節転移の存在は、有意な独立した予測因子として出現した。最後に、EPB41L3遺伝子は、マイクロアレイ解析において、トレーニングコホートを高低メチル化基に体系化することに強く関連していることが判明した。
試験コホートにおけるEPB41L3のマイクロアレイ解析の結果を、定量的メチル化特異的PCRで検証した。PGC組織におけるEPB41L3のMPVは、1変量分析において残骸胃癌のMPVよりも有意に高かった。同様に、リンパ節転移を有するサンプル中のRmvは、リンパ節転移のないものよりも有意に高かった。
従って、適切なH&E染色セクションに従ってマクロ解剖に最も適した癌組織上の同定は、このプロトコルを正常に実行するために必要である。
概要
この記事では、消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析の手順について説明し、メチル化パターンと発がんの関係に焦点を当てています。
主要な研究要素
科学の分野
- ゲノミクス
- エピジェネティクス
- がん研究
背景
- DNAメチル化は遺伝子調節に関与する重要なエピジェネティック修飾です。
- メチル化パターンを理解することで、がん発生に関する洞察が得られます。
- この研究では、複雑なDNAメチル化異常を分析するための費用対効果の高いプラットフォームを使用しています。
- 消化器癌は、その有病率と影響のため、重要な研究分野です。
研究目的
- がん組織におけるDNAメチル化を分析するための信頼性の高い方法を確立すること。
- 消化器癌に関連するエピジェネティックバイオマーカーを特定すること。
- がん患者のメチル化パターンと臨床結果を関連付けること。
使用された方法
- ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片の調製。
- DNA抽出のためのがん組織のマクロ解剖。
- メチル化分析のためのDNAのビスルファイト処理。
- 遺伝子プロモータメチル化を評価するための定量的メチル化特異的PCR。
主要な結果
- がんサンプル間のメチル化パターンの有意な違いの特定。
- EPB41L3遺伝子は胃がんにおけるメチル化状態と強い関連を示しました。
- リンパ節転移などの臨床因子がメチル化パターンの予測因子でした。
- 結果は独立したコホートでの定量的PCRによって検証されました。
結論
- 確立されたプロトコルは消化器癌におけるメチル化変化を効果的に特定します。
- 結果はがん生物学におけるエピジェネティクスの役割の理解に貢献します。
- メチル化プロファイルに基づく標的療法の開発の可能性。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Genome-wide DNA methylation analysis enables biomarker discovery in gastrointestinal cancers by identifying epigenetically altered genes linked to disease progression. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by correlating methylation patterns with clinical phenotypes such as lymph node metastasis. The method provides quantitative, reproducible epigenetic data that can inform biomarker-led screening and preclinical validation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates epigenetic dysregulation to prioritize genes like EPB41L3 with strong association to methylation-defined cancer subtypes.
- Operational Value: Enables functional target validation through methylation-specific PCR confirmation in independent cohorts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking methylation biomarkers to clinical outcomes such as metastasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, bisulfite-converted DNA templates suitable for high-throughput methylation-specific PCR assays.
- Operational Value: Uses cost-effective LA platform with broad genomic coverage for scalable epigenetic screening.
- Assay Readiness: Generates quantitative methylation readouts (RMVs) that enable comparison across sample groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase methylation signatures to clinical-pathological factors in patient cohorts.
- Biomarker Alignment: Identifies EPB41L3 as a methylation-associated gene with potential as a diagnostic or prognostic biomarker in GI cancer.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables stratification of preclinical models by methylation status to improve predictive confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by generating epigenetic data that informs target selection, assay development, and biomarker validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of epigenetic drivers in gastrointestinal carcinogenesis.
- Screening: Enables assay standardization through bisulfite conversion and quantitative PCR readouts.
- Analytics: Delivers methylation quantification and clustering outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects methylation patterns to clinical variables like lymph node metastasis for biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable epigenetic profiling workflow applicable across GI cancer subtypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking epigenetic changes to cancer phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue processing and bisulfite conversion steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating biomarkers in independent test cohorts.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets with strong methylation-clinical correlations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, tissue macrodissection, and bisulfite conversion techniques.
- Dependent on instrumentation for bisulfite treatment, spin-column purification, and real-time PCR.
- Necessitates cross-team standardization of H&E staining and tissue selection protocols.
- Adaptation considerations include varying DNA quality across FFPE sample sources.
- Practical limitation: RNA degradation risk during prolonged heat incubation steps.
