CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス
2020年6月9日
CRISPR-Cas9ゲノム編集システムは、モデル種や非モデル種で使用されている使いやすいゲノムエディタです。ここでは、非モデルの糸状アスコマイセテ菌の交配遺伝子に早期停止コドンを導入するために使用されたこのシステムのタンパク質ベースのバージョンを提示する。
私たちのプロトコルは、非モデル菌に取り組む研究者が研究室で最先端のゲノム編集技術を確立する機会を与えるので、重要です。式システムなどの既存の手法に依存しないため、このプロトコルは非モデルシステムでの確立が容易であるという利点があります。この方法は、異なる真菌種にわたって使用することができ、経路交配、成長、および病原性に関与する遺伝子の機能を解明するために使用することができます。
したがって、この手順を実行する場合、プロトコルを一時停止できる数ポイントしかないので、プロトコルを競合させるためには、十分な連続日数を確保する必要があります。コニディアを収穫するには、無菌実験室布の層を通して、遠心分離のために50ミリリットル遠心分離管に液体培養物をろ過する。5ミリリットルの水でコニディアペレットを再懸濁し、コニディア溶液の10マイクロリットルのアリコートを40倍の倍率で光学顕微鏡で見て、コニディアだけが回収されたことを確認します。
次に、新鮮な1%の麦芽エキススープを500ミリリットルフラスコに200ミリリットル加え、コニディアの全容をフラスコに移します。その後、1分間に120回転で25°Cの振動インキュベーターで液体培養を最大12時間インキュベートします。胚芽を収穫するには、遠心分離のために50ミリリットル遠心分離管に培養を移し、1つのモルソルビトールの最大10ミリリットルで発芽を再懸濁させる。
各種濃度の酵素溶液に1ミリリットルの発芽液を加え、1分間に80回転で振る培養器で2〜3時間胞子酵素溶液をインキュベートします。プロトプラストを収穫するには、無菌実験室布の層を通して酵素溶液を濾過し、遠心分離によってプロトプラストを収集する。次に、200マイクロリットルのSTCバッファーでプロトプラストペレットを慎重に再懸濁し、プロトプラストのみが回収されたことを確認するために、顕微鏡下で溶液の10マイクロリットルのアリコートをチェックします。
変換を開始するには、約5回10〜6個のプロトプラストを、1つのリボヌクレオタンパク質溶液と約6マイクログラムのドナーDNA断片と組み合わせます。次に、ピペットを使用して、作りたての30%PTC溶液をプロトプラスト懸濁液にゆっくりと均等に滴下し、プロトプラストの上に疎水性層を作成し、室温で20分間溶液をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、プロトプラスト懸濁液に5ミリリットルの浸透制御培地を加え、ゆっくりと穏やかにピペットして溶液を完全に混合する。
混合後、一晩80回転/分で振るインキュベーターにプロトプラスト溶液をインキュベートする。翌朝、溶液を5つの60ミリメートル培養プレートに分ける。各プレートにハイグロマイシンBのミリリットルあたり30マイクログラムを添加した浸透性対照培地寒天の10ミリリットルを加え、各プレートをゆっくりと回転させて混合します。
寒天の最初の層は、ハイグロマイシンB2つのプレートのミリリットルあたり40マイクログラムを補った浸透性対照培地寒天の10ミリリットルを追加する前に設定することを許可します。寒天の第2層をセットにした後、単一の分離株が寒天の両方の層を通して成長するのを観察することができるまで、摂氏25度で培養をインキュベートする。正常に変換された単離株を回復するために、個々の成長可能な分離株を、ハイグロマイシンの1ミリリットル当たり50マイクログラムを補った新鮮な麦芽抽出寒天プレートに移 B.Toし、真菌のヘテロトアリック能力に対する標的遺伝子破壊の影響を評価し、1つの突然変異株を有する新鮮な麦芽抽出物アガー培地と反対の交配タイプの株を評価する。
H.omanensisで作業する場合は、蓋をしますが、プレートを密封しないでください。プレートを室温で7日間置きます。インキュベーションの終わりに、性的構造の産生を視覚的に評価する。
変異株のホモタール性能力を試験するために、目的の変異株を有する新鮮な麦芽抽出物寒天培地を接種し、実例のように室温でプレートをインキュベートする。研究されている真菌の増殖速度に対する破壊の影響を評価するには、大きな無菌ピペットチップの裏側を、関心のある各変異体および野生型株の培養の積極的に成長するエッジに挿入して、骨髄で覆われた寒天プラグを作成し、新鮮な麦芽抽出物寒天培地を接種する。カルチャの種類ごとに少なくとも 3 つのレプリケートを実行する必要があります。
摂氏20度で3日間の成長の後、2つの垂直直径の各プレートの成長を測定する。プロトコルの出発材料として使用されるConidiaは、彼らが若い胚芽になるまで発芽し、成長することが許可されています。このような成熟した骨髄ストランドは、劣化には成熟しすぎて使用しないでください。
細胞がもはや細胞壁を持っていないとき、それらは機械的破壊に非常に敏感になり、変形のために収穫することができる丸いプロトプラストを放出する。プロトコルの成功は、変異株のフェノールト分析で確認することができる。この変異MAT127単離について、栄養径成長速度が有意に低下し、新規交配遺伝子に対する多雄性作用を示唆した。
さらに、変異型分離株は、インキュベーションの数日以内に性的サイクル全体を完了した野生型の分離株と比較して、性的胞子を産生しない未熟な性的構造のみを産生する性的サイクルを完了することができない。RNAは非常に敏感であり、非常に容易に分解する。したがって、クリーンな作業環境と氷の上で迅速に作業することは、この実験の成功に不可欠です。
変異型分離物が正常に生成されると、それらは特徴付けられる遺伝子に適した表現型またはRNA-seq分析を行うことができる。
概要
この記事では、非モデル糸状ascomycete真菌用に設計されたタンパク質ベースのCRISPR-Cas9ゲノム編集システムを紹介します。このプロトコルにより、研究者は容易にラボでゲノム編集技術を確立でき、交配、成長、病原性に関連する遺伝子機能の研究を促進します。
主要な研究要素
科学分野
- 遺伝学
- 真菌学
- ゲノム編集
背景
- CRISPR-Cas9は広く使用されているゲノム編集ツールです。
- 非モデル真菌は遺伝子操作に独特の課題を提示します。
- 既存の技術は複雑な発現システムに依存していることが多いです。
- この研究は、より簡単なタンパク質ベースのアプローチを導入します。
研究目的
- 非モデル真菌におけるゲノム編集の簡単な方法を提供する。
- 真菌の交配と成長における遺伝子機能の研究を促進する。
- 真菌の発生における遺伝子破壊の影響を評価する。
使用した方法
- 真菌培養から分生胞子と芽を収穫する。
- リボ核タンパク質とドナーDNAを使用してプロトプラストを形質転換する。
- 選択培地上で形質転換された分離株の培養と選択を行う。
- 成長と交配能力を評価するための変異株の表現型解析。
主な結果
- 真菌株の成功的な形質転換が達成されました。
- 変異株は成長速度の低下と交配構造の変化を示しました。
- 表現型解析により遺伝子破壊の影響が確認されました。
- 生成された変異株に対してRNA-seq解析を行い、さらなる洞察を得ることができます。
結論
- タンパク質ベースのCRISPR-Cas9システムは非モデル真菌に有効です。
- この方法はゲノム編集プロトコルの確立を簡素化します。
- 真菌遺伝学と生物学の研究に新たな道を開きます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
CRISPR-Cas9 genome editing in Huntiella omanensis enables precise genetic interrogation in non-model filamentous fungi, addressing a key gap in early discovery for fungal biology. This capability supports functional gene analysis relevant to growth, mating, and pathogenicity, enhancing predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for fungal systems. The protocol's accessibility and efficiency position it as a reusable platform for portfolio-wide gene function studies in diverse fungal species.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables targeted gene disruption to clarify gene function in mating, growth, and pathogenicity pathways.
- Supports mechanistic de-risking by allowing direct assessment of gene knockout phenotypes.
- Facilitates functional target validation in non-model fungal systems where traditional tools are limited.
- Provides a foundation for predictive confidence in downstream biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Generates validated mutant strains for use in phenotypic screening and pathway analysis.
- Standardizes transformation and selection workflows for reproducible mutant generation.
- Enables quantitative measurement of growth and reproductive phenotypes for assay development.
- Prepares engineered strains for scalable screening of compound effects on defined genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene function studies with disease-relevant fungal traits, supporting translational biomarker discovery.
- Provides continuity from genetic manipulation to phenotypic and transcriptomic analysis.
- Enables risk-adjusted advancement of fungal targets based on functional validation.
- Supports mechanistic insights that inform preclinical model selection for antifungal research.
Pipeline & Workflow Integration
This CRISPR-Cas9 protocol integrates into the discovery continuum from early gene function interrogation through mutant strain generation and phenotypic analysis, supporting both target validation and assay development in fungal R&D.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted gene truncation and knockout.
- Screening: Produces reproducible, selectable mutant strains for downstream phenotypic and compound screening.
- Analytics: Delivers quantitative growth and reproductive readouts, supporting statistical comparison of mutant and wild-type strains.
- Translational Research: Connects gene disruption to observable phenotypes, informing biomarker and target selection for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a broadly applicable genome editing workflow for diverse non-model fungal species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in fungal gene function studies.
- Operational Value: Standardizes genome editing and selection protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient target prioritization in fungal R&D portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-species applicability for gene function interrogation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fungal culture, protoplast preparation, and transformation techniques.
- Needs access to quality sequence data for guide RNA and donor DNA design.
- Demands careful cross-team standardization of transformation and selection steps.
- Adaptation may be necessary for different fungal species or gene targets.
- Protocol timing and RNA handling require strict adherence to prevent degradation and ensure success.
