Name: 3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶ 3Dスフェロイドを用いたがん細胞浸潤とT細胞毒性の同時評価法。アガロースマルチマイクロウェルキャストでスフェロイドを作製し、コラーゲン基質に埋め込むことで、免疫細胞と腫瘍細胞の相互作用をリアルタイムで解析できます。

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3Dコカルチャーモデルのアプローチに関する有益な議論やアドバイスをしてくれたヴァージニー・オリ博士に感謝します。また、エリザベス・ジョーンズのIHC断面に関する優れた技術支援に感謝します。この研究は、DFG(ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト)からYL(LI 2547/4-1)および国立衛生研究所からAW(R01 CA231291)、ATR(R01 CA205632)、GWP(R01 CA218670)への助成金とCA00がんセンターのコアグラント(Ca00がんセンター)への助成金によって支えられた。

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著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ここで提示される方法は、T細胞との共培養、細胞ベースの機能的および分子アッセイ、ならびに単一の装置を用いた様々なモニタリングおよび分析の可能性を可能にする3D腫瘍スフェロイド生成について説明する。我々のアプローチの大きな利点は、3D培養物を別のアッセイに移す必要がなくて、アッセイ全体で3D培養の完全性を維持する点です。
ここで示すワークフローは、必要に応じて変更できます。スフェロイド形成のためのインキュベーション時間は、T細胞共培養または細胞毒性アッセイ、異なる実験条件または細胞株に対して変更される必要がある場合がある。
アッセイ全体にはいくつかのステップがあり、プロトコルに密接に準拠する必要があります。これらは一般に、共培養のための第2の細胞株を添加する前に細胞培養培地を除去し、また、アガロースキャスト内のECMまたはヒドロキセチルアガロース処理ゲルに3D培養物を埋め込む。それは、ウェルプレートを傾け、マイクロピペットでチャンバーの一角をターゲットにすることによって、ゆっくりと慎重に播種室の媒体を除去することが絶対に重要です...

過去10年間のがん免疫療法の大幅な改善にもかかわらず、治療に対する感受性と耐性に関する私たちの機械学的理解はまだかなり貧弱です。腫瘍が実質的な不均一性を示し、腫瘍細胞とそれらの微小環境および免疫細胞との動的相互作用が、腫瘍細胞死に影響を与え、免疫療法11、2、32,3を含む治療に対する侵襲的な行動および応答を示すことが十分に確立されている。適応免疫系の一つの腕として、T細胞は細胞特異的細胞毒性を実行する。T細胞認識とがん細胞への応答の分析は、免疫調節治療に対する耐性と感受性に関する機械的な洞察を提供します。
適切な環境におけるがんとT細胞の相互作用をインビトロでモデル化し、モニタリングすることは困難であり、これまでのところ、限られた機械主義的な洞察をもたらしました。ほとんどの細胞ベースのアッセイは、生体,内生理学44、5、6、すなわち空間細胞相互作用、細胞外マトリックス(ECM)7との接触、5動的代謝需要、質量増殖による低酸素増加8、および微小微生物(TME)の微小環境(9ME)の影響による増大する3次元(3D)を再現するために重要な重要な特徴を欠く2次元(2D)環境に依存している。679一方、現在使用されている3次元(3D)共培養と侵略アッセイシステムには、まだ多くの欠点があります:(1)スフェロイド生成と,収穫5、10、(2)10スフェロイド5サイズの制御の欠如の時間を消費する性質、 形状および細胞密度11、12、(3)12低スループット型アッセイは、(4)特殊機器13、14、(5)異なるアッセイ111415、16、17,16に対する異なる環境に共培養を移す必要性を要求する。,17特に、共培養アッセイの転移は、しばしばスフェロイドの破壊および共培養完全性の喪失をもたらす。これは、細胞-細胞接着が減少した「緩い」スフェロイドに特に当てはまります。例えば、ほとんどの3Dの侵略アッセイは、スフェロイドが最初の形成後に収穫され、ECM 14、15、1615,16で再中断されることを要求する。14このリサスペンションステップは、回転楕円体間の距離に対する制御の損失をもたらす。腫瘍スフェロイド間の距離は侵襲的な挙動に影響を与えるので、この制御の喪失は高いアッセイ間分散を導入し、再現性を低下させる。さらに、末梢および腫瘍スフェロイド浸潤免疫細胞の評価のための連続した遠心分離工程による細胞分画アッセイの適用は、より安定したスフェロイド17を生成する腫瘍細胞集団に限定される。
コンセプトとアプローチ
当社のアプローチでは、上記の不具合に対して、後述のアッセイ用に回転楕円体の移動を必要としない「オールインワン」3Dスフェロイド共培養モデルを使用して対処しています。我々は、スフェロイド形成装置( 材料表を参照)を適応させ、同時に癌細胞の侵襲的挙動と共培養T細胞の細胞傷害性をモニタリングするためのアッセイを生成した。この方法はユーザーフレンドリーで安価で、比較的高スループットの3D設定で迅速かつ容易に処理できます。使用される装置のタイプに依存して、最大81の大きい均一サイズのスフェロイドは、播種された細胞の数を変更することによって個々のスフェロイドサイズを制御して単一のピペットステップで生成することができる。スフェロイド形成は、U字型の底部を有する足場を含まないアガロースマルチウェルキャストにおける細胞間相互作用の強化によって強制される。この3Dシステムは、動的細胞ベースの機能研究と、蛍光活性化細胞選別(FACS)、免疫蛍光(IF)または免疫組織化学(IHC)染色、無傷の3D共培養の遺伝子発現解析を含むエンドポイント分子および生化学的アッセイに適応させた。
機能研究のために、アガロースキャスト内のI型コラーゲンにスフェロイドを埋め込むと、等距離のスフェロイドからの癌細胞の浸潤を生じ、単一細胞対集団細胞移動18、19,19などの必須細胞株特異的特徴をモニタリングすることを可能にする。さらに、コラーゲンマトリックスはアガロースキャストから容易に分離され、複数のスフェロイドを含む1\u20122 mmの厚さのパッチをもたらし、共焦点顕微鏡によるIF染色およびイメージングのためにさらに処理することができる。これにより、ハイスループットスクリーニングで細胞浸潤と細胞マトリックス相互作用が明確に明らかになります。また、コラーゲンマトリックス中の細胞は、コラーゲン消化後に単一細胞解離後に分離して、その後の細胞培養または分析を行うことができる。
スフェロイドのIHC分析では、アガロースキャストの固定および切除後、タンパク質または関心のある他の分子が、スフェロイドの地理的位置を維持しながら検出可能である。ここで説明するアプローチでは、スフェロイドはアガロースキャスト内のHydroxyethylアガロース処理ゲルに直接埋め込まれ、ゲルはマイクロウェルの底部にスフェロイドを保持する「蓋」として機能する。アガロースキャスト20のパラフィン埋め込み後、連続横切りは、キャストの底部を出発点として行う。
このアプローチは、Hydroxyethylアガロース処理ゲル21 に埋め込む前に細胞の収穫を必要とするスフェロイドの従来のIHC断面とは対照的であり、このように細胞の空間配置を失うスフェロイドの破壊を招くリスクがある。また、腫瘍スフェロイド17 に浸潤した免疫細胞または末梢のいずれに免疫細胞が直接埋め込まれるのかを評価するための遠心分離による細胞分画は、直接埋め込むことによって回避される。
さらに、3D共培養は、腫瘍、間質または免疫細胞を付着させることによって行うことができる、そしてこのように腫瘍細胞クロストークを研究するか、または内皮細胞16との共培養を含む細胞間相互作用を分析するための異なる腫瘍微小環境を再現する。
この3Dスフェロイド共培養設定は、腫瘍微小環境に存在する異なる細胞タイプの共培養を行い、改変されたECM要素の効果を評価するために使用することができる。I型コラーゲン以外にも、他のECM成分(例えば、マトリゲル、マトリゲル/コラーゲン混合物、フィブロネクチン)は、腫瘍細胞浸潤が異なる基質22の存在によって影響を受けるので使用することができる。また、アガロースキャストのマイクロウェルは、一次細胞株のスフェロイド形成および低細胞接着を有する細胞に適している。

<table><tbody><tr><td>3Dシャーレ</td><td>Microtissues Inc</td><td>Z764019 &Z764051</td>プロトコル<td>では「ゴム型」と呼ばれています。81-microwell & 35-microwell molds</td></tr><tr><td>8-well Chamber Slides</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Type I, low EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td><td>Agilent</td><td>K4003</td><td>ready to use</td></tr><tr><td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ4型、1g</td><td>ワーシントン</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、ウシ胎児血清</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092、16000044</td>「ヒドロキシエチルアガロースプロセッシング」と呼ばれるプロトコルHarris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>ThermoFisher</td><td>HG-4000-012</td>で「細胞培養培地」と呼ばれます<td>プロトコルのゲル」</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>1/1000 希釈</td></tr><tr><td>ファロイジン 546</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>486624 1/200 希釈</td></tr><tr><td>ウサギ 抗CD8抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>98941</td><td>1/25 希釈</td></tr><tr><td>ラット 抗ケラチン 8</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I AB_531826</td><td>1/500 希釈</td></tr><tr><td>RNeasy ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td></td><td>T細胞培養培地</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407の</td>プロトコルRPMI ThermoFisher 11875093では「RNA抽出キット」と呼ばれ、プロトコルTrizol ThermoFisher 15596026プロトコル<td>では「オクトキシノール」</td></tr>と呼ばれ、プロトコルTween <tr><td></td><td></td><td></td> 20<td>では「フェノールを含むグアニジンチオシアン酸」と呼ばれ</td></tr>ています。<tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td>は、<td>プロトコルでは「ポリソルベート20」</td></tr>と呼ばれ、<tr><td>TypLE</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td>プロトコルでは「細胞解離酵素溶液」と呼ばれます</td></tr></tbody></table>

3d培養におけるがん細胞浸潤とt細胞毒性のモニタリング

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

多くの癌は治療に耐性を持ち続けているが、免疫療法による癌の治療には大きな進歩が見られた。アッセイの限られた数は、腫瘍と免疫細胞の相互作用に直接監視し、機械化的な洞察を可能にし、その中で、T細胞は、癌細胞に対する適応免疫系の細胞傷害応答を実行する上で重要な役割を果たす。ほとんどのアッセイは、使用の相対的な容易さによる細胞の2次元(2D)共培養に基づいていますが、癌細胞の特徴の1つである侵襲的な成長表現型の表現は限られています。現在の3次元(3D)共培養システムは、特別な装置または共培養癌細胞の侵入と相互作用T細胞のための別々の監視を必要とします。
ここでは、共培養における癌細胞スフェロイドとT細胞細胞毒性の3Dにおける侵襲的挙動を同時にモニタリングするアプローチについて述べている。スフェロイド形成は、U字型の底部を有する足場を含まないアガロースマイクロウェルキャストにおける細胞間相互作用の強化によって駆動される。T細胞共培養および癌細胞の両方のI型コラーゲンマトリックスへの浸潤は、アガロースキャストのマイクロウェル内で細胞を転移することなく行われ、アッセイ全体で無傷の3D共培養システムを維持する。コラーゲンマトリックスはアガロースキャストから分離することができ、免疫蛍光(IF)染色および細胞の共焦点イメージングを可能にする。また、細胞は、さらなる増殖のために単離したり、遺伝子発現や蛍光活性化細胞選別(FACS)などの分析を行ったりすることができる。最後に、3D共培養は、埋め込みおよび切除後の免疫検査(IHC)によって分析することができる。アッセイの可能な修飾は、細胞外マトリックス(ECM)の変質された組成物だけでなく、癌細胞と異なる間質または免疫細胞を含めることが含まれる。

3Dの共培養モデルは、必要に応じて組み合わせたり変更したりできる 、図1Aに示すさまざまなアッセイを可能にします。我々の確立された実験セットアップにおいて、腫瘍およびT細胞は、侵襲的および/または耐性腫瘍細胞の選択のための浸潤アッセイの開始に続いて2日間共培養される(図1B)。4日目に、浸潤の定量が行われ、「生存者」細胞はコラーゲンマトリックスから単離されるか、またはマトリックスからのRNA23 またはDNA抽出のために直接処理される(図1B)。アガロースキャストのマイクロウェル内に3D培養をI型コラーゲンに埋め込むことで、画像Jを使用して最初にソフトウェアのフリーハンドドローツールを使用して全領域を区切り、次に、境界されたスフェロイド領域(図2A)上の比率を計算し、スフェロイドを残す「スパイク」の数を数えることによって、侵入の監視と分析を行うことができ...

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

これらの方法は、免疫細胞介在性腫瘍細胞傷害性および侵襲的行動に対する3D設定における機械的な洞察を提供することができる。この技術の主な利点は、この3Dスフェロイド共培養モデルは、複数の後続のエッセイのためのスフェロイドの転送を必要としないことです。この手順をデモンストレーションすることは、私たちの部門の博士課程の学生であるアプスラ・ナシルです。細胞培養フードで無菌技術を用いてスフェロイドを生成するには、500マイクロリットルの溶融アガロースを81マイクロウェルゴム型に加え、気泡を避けるように注意を払う。アガロースが慎重に固まった場合、12ウェルプレートの個々の井戸にアガロースキャストを飛び出すためにゴム型を曲げます。各ウェルに10%の牛血清を添加した細胞培養培地の2.5ミリリットルを各ウェルに加え、1時間細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。インキュベーションの終わりにプレートを傾けて、まず周囲の細胞培養培地を除去し、次に播種チャンバー内で、各細胞の播種室に滴下して腫瘍細胞懸濁液に調製した190マイクロリットルを慎重に播種する。細胞培養インキュベーターで15分間インキュベーターを加えた後、キャストの外側に培地2.5ミリリットルで添加し、プレートを48時間インキュベーターに戻します。T細胞共培養を設定するために、適切な数のT細胞を190マイクロリットルの不適切なT細胞培養で再懸濁し、12ウェルプレートまでウェル毎に培地を、アガロースキャストを取り巻く細胞培地を除去することを可能にした。次に、播種室で、回転楕円体を取り除かずに、回転楕円体が吸引されたかどうかを確認し、P200に装填されたピペットを各キャストの約半センチメートル上に保持し、T細胞をスフェロイドを除去することなくドロップワイズの方法で慎重にキャストに播種します。すべてのキャストを播種すると、15分間プレートを細胞培養インキュベーターに戻してから、胎児ウシ血清を添加した新鮮な細胞培養培地を各キャストの外側にさらに48時間のインキュベーションを加えた。3D共培養物を1型糖尿病のコラーゲン希釈ストックコラーゲンに血清フリーベース培地を用いたコラーゲンを1ミリリットル当たり3ミリグラムの最終作業濃度に埋め込み、10X PBSの11マイクロリットルを加える場合は、100マイクロリットル当たり1.2マイクロリットルの水酸化ナトリウムを1.2マイクロリットル加える。1時間氷上でコラーゲン溶液を中和した後、デモンストレーションしたように、周囲および各キャスト内の細胞培養培地を除去する。中和したコラーゲンを各キャストに慎重に加え、ドロップワイズで投げ、すぐにプレートを5分間培養インキュベーターに戻してから、インキュベーションでさらに1時間プレートを反転させた。インキュベーションの最後に、プレートを右側にバイオセ

monitoring-cancer-cell-invasion-and-t-cell-cytotoxicity-in-3d-culture

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

このビデオでは、3D基底膜タンパク質マトリックスで乳がん細胞を増殖させる詳細な方法論を提供し、周辺環境への細胞浸潤の評価における3D培養の可能性を例示しています。...

3D培養基底膜アッセイ:3D基底膜タンパク質マトリックス上でがん細胞を培養し、細胞浸潤を研究する

このビデオでは、腫瘍細胞の浸潤を研究するためにネイティブマトリックスを利用する技術について説明しています。このアッセイで使用される技術は、合成マトリックスや外来マトリックスを必要とせずに、3D設定で上皮-間葉系細胞の相互作用を評価する能力を提供します。...

腫瘍細胞浸潤アッセイ:上皮間葉系細胞の相互作用を評価するための3D In Vitroネイティブマトリックスベースの方法

このビデオでは、腫瘍スフェロイドとT細胞の三次元共培養を確立する方法を示します。腫瘍スフェロイドを含むマイクロウェルを有するアガロースキャストを調製し、続いてT細胞を添加する。インキュベーション後、このセットアップにより、制御された3次元環境でT細胞と腫瘍スフェロイドとの相互作用を研究することができます。...

腫瘍スフェロイドにおける浸潤T細胞の三次元共培養モデル

この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。...

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

がん細胞をコラーゲンゲルに包埋し、その後、無細胞フィブリンゲルに挟み込むことで、浸潤性と衛星腫瘍の形成をモニタリングできる3D培養システムを生成します。...

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の...

侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

侵襲的な細胞亜集団をリアルタイムで検出して捕捉するアプローチについて説明します。実験計画では、セルの電気インピーダンスの変化を監視することによってリアルタイムセルラー解析を使用しています。浸潤性癌、免疫、内皮または間質細胞を複雑な組織に捕捉することができ、共培養の影響を評価することができる。...

共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉

浸潤は、がんの発生と進行における主要な生物学的現象です。このプロセスは、腫瘍微小環境の非腫瘍性細胞および成分の影響を受けます。この研究の目的は、三次元(3D)培養を使用して in vitro...

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

学ぶ 3Dスフェロイドを用いたがん細胞浸潤とT細胞毒性の同時評価法。アガロースマルチマイクロウェルキャストでスフェロイドを作製し、コラーゲン基質に埋め込むことで、免疫細胞と腫瘍細胞の相互作用をリアルタイムで解析できます。

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

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