In Situ X線回折研究のためのマイクロダイアルシスによるチップ上のタンパク質の結晶化

本論文では、透析法とX線回折実験を用いて、オンチップタンパク質結晶化のために開発されたマイクロ流体チップの製造プロトコルについて詳しく述べる。微細加工プロセスにより、半透膜再生可能なセルロース透析膜を、チップの2層間の任意の分子量カットオフと統合することが可能になります。

本論文では、透析法によるオンチップタンパク質結晶化および室温でのX線回折実験で開発されたマイクロ流体チップの製造プロトコルについて述べる。これらのマイクロチップの主な利点の1つは、製造材料の選択であり、室温でのSitu X線回折データ収集に適合するチップをレンダリングします。オンチップの結晶化実験では、タンパク質サンプルの少量が必要であり、これらの高価値の高い高分子での作業の全体的なコストを削減します。

オンチップ結晶化はまた、従来の結晶学実験の間に凍結冷却と組み合わせて頻繁に適用される脆弱なタンパク質結晶の手動収穫を排除する。また、ミクロミチップスは、半透過膜を通して沈殿物濃度を平衡化することを目的とした拡散ベースの方法であるタンパク質結晶化にマイクロ透析を用い、タンパク質結晶化のためのクロミュレント濃度に近づき、結晶化条件を精密かつ可逆的に制御することができます。温度制御と組み合わせたマイクロ透析は、同じタンパク質サンプルを使用しながら沈殿物濃度を変化させることによって、結晶成長から核形成を切り離して相図を調べるのに使用することができる。

まず、PDMSシリコーンベースの50グラムを調製し、10〜1質量比で硬化剤です。2つの材料をヘラとビーカーに混ぜます。混合後、すべての気泡を除去するために真空チャンバーに混合物を置きます。

マイクロ流体チャネルと柱のパターンを含むマスターに最初のSU8に、約5ミリメートルの高さまで、プレミックスPDMSの25グラムを入れます。次に、残りの25グラムのPDMSを第2のSU8マスターに注ぎ、柱のパターンのみを含む。338ケルビンでオーブン内の2つのPDMS層を1時間硬化させます。

メスでSU8マスターのパターンの周りに硬化PDMS層をカットし、シリコンマスターからPDMS金型を穏やかに剥がします。PDMS金型を配置し、チャネルと柱の両方を上向きのパターンでスライドした硬い顕微鏡のガラススライド上に配置します。再生セルロース透析膜の小片をカットして、タンパク質チャンバーとして設計されたPDMSモールドの中央柱を覆います。

透析膜の分子量カットオフは、タンパク質試料の分子量に応じて選択され、結晶化液の沈殿物とがこれに応じて選択される。次に再生セルロース透析膜の乾燥片を慎重に分離する。分離透析膜の小片を切ります。

膜のこの部分のサイズは、チップの設計に依存します。具体的には、中央柱の寸法に依存します。ガラススライドに支えられたPDMS型の中央柱に透析膜の部分を堆積させ、その柱とチャネルを上向きにします。

次に、ガラススライド上で既にサポートされているPDMS金型の上に、下向きの柱だけを備えた2番目のPDMS金型を配置します。2 つの PDMS 金型のすべての柱を位置合わせします。再生セルロース透析膜の部分は、PDMS金型の2つの中央柱の間に挟まれている。

製造手順のこのステップは、光学顕微鏡の下で、または単に目視ですべての柱の位置合わせを慎重に検査することによって行うことができます。PDMS金型内の閉じ込められた気泡を除去するために、真空チャンバーにアセンブリを置き、30分間乾燥させ、光硬化性NOA樹脂の挿入を増強し、このプロトコルの次のステップで説明する。真空チャンバからアセンブリを取り出し、2つのPDMS金型の間の空きスペースを、毛細血管インビビジョンによって光硬化性チオリン系樹脂NOA 81で満たします。

アセンブリの4つの側面のうちの3つの樹脂を塗布します。アセンブリをクロスリンカーに入れ、1平方センチメートルあたり35ミリワットのコリメートUVランプを使用して、8秒間UV光にさらしてNOA樹脂を硬化させます。顕微鏡ガラススライドの標準寸法で175マイクロメートルの厚さのPMMAピースをカットし、PMMAピースの両側からプラスチック保護を剥がします。

最初のUV露光が完了したら、下部PDMS金型とガラススライドから部分的に架橋されたNOA樹脂が貼り付けられた上部PDMS金型を取り外します。上部 PDMS 金型のアセンブリと PMMA ピース上の部分的に硬化した NOA 樹脂を静かに押します。クロスリンカーに新しいアセンブリを配置し、60秒間UV光に曝露することによって、再びNOA樹脂を硬化させます。

上部 PDMS 金型は慎重に取り外します。再生セルロース透析膜を埋め込み、PMMAピースでサポートされている完全クロスリンクNOA樹脂で作られた透析チップは準備ができています。高速エポキシ接着剤とマイクロ流体チャネルの入口および出口点に市販のコネクタを結合します。

流体の取り扱いについては、コネクタのサイズに基づいて PTFE チューブの直径を選択します。チューブは、透析チップの流体チャネル内の結晶化溶液の導入に使用されます。ピペットは、透析膜のすぐ上に位置するタンパク質貯蔵所内のタンパク質サンプルの液滴を手動で行う。

タンパク質液滴の体積は、使用されているマイクロチップの設計に依存します。具体的には、中央柱の体積に依存し、0.1または0.3マイクロリットルであることができます。タンパク質貯留層の周りには、高真空シリコーングリースの薄層を慎重に塗布します。

PMMAの小片をカットし、シリコーングリースの薄い層の上にそっと置きます。タンパク質貯留層の上に置かれたPMMA部分を覆い、すべての端の周りにNOAチップに貼り付けるのに十分な大きさのカプトンテープを切ります。タンパク質サンプルはリザーバー内に封入され、チップは結晶化実験に使用できます。

まず、緩衝液と沈殿液の適切な体積を混合して、結晶化液の約500マイクロリットルを調製する。透析チップの点に、シリンジを使用するか、自動圧力駆動システムを使用して、流体コネクタを介して結晶化液を注入します。流体チャネルが結晶化溶液で満たされ、内部に空気が閉じ込められなかったら、パラフィルムテープでチップの入口と出口ポートを密封します。

ピペットは、タンパク質貯留層内のタンパク質溶液の適切な体積を、既に説明したようにタンパク質サンプルを封入する。タンパク質の結晶成長を視覚化し、デジタルカメラで記録することができます。透析マイクロチップの製造のために、我々は光学的に透明で生物学的に不活性な材料を選択し、その中でのX線回折実験のための高い適合性を実証した。

X線ビームの直接経路にあるチップのタンパク質区画を含む材料によって発生するバックグラウンドノイズが評価された。タンパク質コンパートメントは、再生セルロース透析膜、カプトンテープ、および2つのPMMA層からなり、1つはマイクロチップの基質として使用され、1つはタンパク質サンプルのカプセル化に使用される。この図では、カプトンテープ、再生セルロース透析膜、PMMA層、及びそれらの組み立てにより発生するバックグラウンドノイズを示す。

光硬化性樹脂NOAはマイクロチップの本体を含むが、タンパク質チャンバの一部ではないため、この測定には含まれない。X線と材料との相互作用に起因する拡散リングは、4つのオングストロームより低い解像度でカプトンテープ、4~8オングストローム間のPMMA、および4~5オングストローム間の透析膜に対して見ることができます。チップによって発生する総バックグラウンドノイズは主に6オングストロームより低い解像度で観察され、リゾチームの高分解能回折データの処理は影響を受けないことを示している。

マイクロチップは、X線回折実験で設計した3DプリントサポートでX線ビームの前に取り付けられ、最大3つのチップを同時に保持することができます。マイクロジアルシス法によるモデル可溶性タンパク質のオンチップ結晶化に関するマイクロチップの効率を評価する実験を行った。リソチーム結晶は2つの異なる条件で293ケルビンで成長した。

最初の結晶化条件は、1.5モル塩化ナトリウム、および0.1酢酸モルナトリウムを含んでいた。第2の結晶化条件は、塩化モルナトリウム、酢酸モルナトリウム0.1モル、ポリエチレングリコール400を含み、マイクロチップとマイクロ透析法との相溶性を示すために選択され、高分子量および粘性溶液の沈殿物を有する。結晶化実験は、静的条件下で行った。

ライソチームの結晶をマイクロチップ上で成長させた後、室温でのX線回折実験に使用した。マイクロチップは、3Dプリントされた支持体の助けを借りてビームラインに取り付けられ、完全なX線回折データセットを2つのリソチーム結晶から収集した。X線回折データの処理後、1つのリゾチーム結晶の電子密度マップを1.95オングストローム分解能で得た図A.図Bに示すように、1.85オングストローム解像度で得られた電子密度マップを示す。

2つの異なるリソチーム結晶から得られた2つのデータセットをマージした後、両方の電気密度マップは、単一または複数のタンパク質結晶から、室温で透析マイクロチップに直接行われたX線回折実験で得ることができる詳細な構造情報を示しています。マイクロ透析法によるオンチップタンパク質結晶化用に設計されたマイクロ流体デバイスの製造手順、室温でのX線回折実験を実証しました。X線透過性の高い作製材料を使用し、その際に使用するタンパク質結晶学に対応しました。

回折データ収集は、高分子結晶性ビームラインに直接取り付けることができるチップの3Dプリントサポートを使用して自動化されています。このマイクロチップの多様性は、小タンパク質体積を使用して結晶化条件を可逆的に制御し、相図をマッピングするためにマイクロ透析を使用することから生じる。装置のプロトタイプ作成は簡単で、比較的安価な材料で、クリーンルームで1日に最大30個のマイクロチップを製造することができます。

チップのこれらの特徴は、より困難なタンパク質標的の連続X線結晶学研究に使用できることを期待しています。