ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる
January 18th, 2021
骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。
このプロトコルの全体的な目標は、筋肉疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉再生を調べ、定量化することです。この方法は、費用対効果が高いだけでなく、in vivo設定で病気の筋肉の再生電位をスコアリングする上で非常に再現性の高い高スループットパイプラインを提供します。私と一緒に手順を実証することは、オーストラリア再生医学研究所の研究員であるアヴニカ・ルパレリアです。
生きた胚のジェノタイピングでは、24室のDNA抽出チップの上面から透明な保護フィルムを剥離し、カットチップ付きの20マイクロリットルフィルターチップを使用して、13マイクロリットルの胚培地中の単一の麻酔付き胚をチップの各チャンバーに移します。すべての胚がロードされたら、1つの側を最初に配置し、続いてチップの残りの部分を置くことによって、ゼブラフィッシュ胚ジェノタイピングプラットフォームにチップを静かに取り付けます。磁気プラットフォームの蓋をチップの上に貼り付けて、DNA抽出プロトコル中に胚媒体の蒸発を防ぎ、蓋を閉じます。
ベースユニットを2.4ボルト、0.051アンペア、0.12ワットに設定し、DNA抽出プロトコルを開始します。プラットフォームは、蓋を静かに触れることによって評価することができる振動を開始する必要があります。プログラムが実行されている間に、各ウェルに1ミリリットルの胚培地を加えて24ウェルプレートを準備し、各胚からのDNA材料の収集に使用される8ウェルストリップチューブにラベルを付けます。
8分間の抽出の後、オン/オフボタンを押してプラットフォームの振動を止め、磁気蓋を静かに取り外し、チップをプラットフォームから持ち上げます。1つのチャンバーから10マイクロリットルの胚培地を8ウェルストリップチューブの適切な井戸に移し、すぐに2滴の新鮮な胚培地をチャンバーに加える。胚をチャンバーから、以前に調製した24ウェルプレートの適切なウェルに移します。
すべての胚が移された時、プレートを28°Cのインキュベーターに入れる。8ウェルストリップチューブに集められた遺伝物質に対して適切な下流のジェノタイピングアッセイを実行し、各胚の遺伝子型を決定する。各胚の遺伝子型が同定されたら、25ミリリットルの中水を含む90ミリメートルのペトリ皿に胚を移し、筋肉が損傷するまで28°Cでプレートをインキュベートする。
受精後4日で、ピペットを使用して1匹の麻酔幼虫を新しいペトリ皿に移し、解剖顕微鏡で余分な培地を皿から慎重に取り除きます。魚の向きを左に、尾が右にあり、背部領域が上にあり、腹側領域が下がるように、30ゲージ針を使用して、肛門の上の精液筋の1〜2つのスマイトに迅速に正確な刺し傷を行い、ミオセプタムに水平に向けます。負傷したゼブラフィッシュに胚培地の滴を塗布し、幼虫を井戸あたり1ミリリットルの新鮮な胚培地を含む24ウェルプレートの1つの井戸に慎重に移します。
すべての幼虫が負傷した場合は、ゼブラフィッシュが画像化されるまで、プレートを28°Cのインキュベーターに入れる。筋肉の再生を定量化するには、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで 1 日の傷害後画像を開き、ポリゴン ツールを使用して創傷部位の周囲に図形を描画します。このソフトウェアを使用して領域を測定し、領域の複屈折強度を意味し、これらの値を提供されたテンプレートのセルD3およびE3にコピーします。
1~2個のスマイトにまたがる2つの追加領域をそれぞれ描き、その領域を測定し、これらの領域のそれぞれの複屈折強度を意味する。これらの値をテンプレートのセル D4 と D5、E4 および E5 にコピーします。その後、損傷後3日間の画像で同じ領域の測定を繰り返します。
複屈折が全ての画像で同様に測定された場合、各領域の平均複屈折強度をその領域で割って各領域の正規化複屈折を計算する。各時点について、2つの損傷のない領域の平均正規化複屈折を計算して、損傷していない筋肉の基準点を提供する。1日目の傷害後の筋肉損傷の程度を決定するために、傷害領域の正常化された複屈折を、損傷していない領域の平均正常化された複屈折で割る。
筋肉再生の程度を決定するために、損傷後3日間の傷害領域の正規化複屈折を、この段階での損傷していない領域の平均正常化された強度で割る。最後に、3日目の術後の筋肉再生の程度の値を、1日目の傷害後の筋肉損傷の程度の値で割って回生指数を計算する。この代表的な分析では、2つのLama2ヘテロ接合ゼブラフィッシュの間の十字架からの胚のクラッチをDNA抽出チップに移し、その後遺伝子型化した。
筋肉の傷害は、1日目の1日目の傷害後に複屈折強度の低下をもたらすが、筋肉の再生に成功すると、同じ領域内での複屈折の増加をもたらす。また、野生型の幼虫は正常な筋肉のパターニングに起因する均一な複屈折強度を示す一方で、Lama2ノックアウト幼虫の筋肉の複屈折強度は不均一であり、筋肉の完全性が低下する可能性が高い。観察されたように、野生型とLama2欠損幼虫の両方が、傷害後1日の1日に比べて傷害部位の複屈折強度が有意に増加したことを示し、筋肉が再生したことを示す。
再生指数の決定は、Lama2欠損幼虫が野生型動物と比較して筋肉再生の顕著な増加を示すことを明らかにする。このプロトコルは、筋肉疾患のモデルで再生する筋肉の能力の変化を特定することができますが、下流の細胞および分子分析は、観察された変化の原因となるメカニズムを特定するために行う必要があります。この方法により、筋幹細胞機能の障害や関連ニッチ元素の障害が筋疾患の病態にいかに寄与しているかを特定することができ、新しい疾患メカニズムを同定することができました。
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概要
このプロトコルは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生を検討し定量化する方法を概説します。in vivo で筋疾患の筋肉の再生能力を評価するためのコスト効果が高く再現可能なアプローチを強調します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 再生医療
- 筋生物学
背景
- 骨格筋の再生は組織に常駐する筋幹細胞に依存します。
- 筋ジストロフィーのような筋疾患はこれらの幹細胞を損ないます。
- 筋再生メカニズムの理解は治療法の開発にとって重要です。
- ゼブラフィッシュモデルは筋再生を研究するためのユニークなin vivo システムを提供します。
研究の目的
- 筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生を検討すること。
- 筋再生を評価するための高スループットのパイプラインを確立すること。
- 再生能力をスコアリングするための再現可能な方法を提供すること。
使用された方法
- DNA 抽出チップを使用した生体胚の遺伝子型決定。
- 麻酔をかけた胚を分析用チャンバーに移動すること。
- チップをゼブラフィッシュ胚の遺伝子型決定プラットフォームに取り付けること。
- DNA 抽出プロトコル中の蒸発を防止すること。
主な結果
- このプロトコルにより筋再生の効率的な検討が可能になります。
- 再生結果のスコアリングにおいて高い再現性が達成されました。
- 大規模研究に適したコスト効果の高いアプローチ。
- オーストラリア再生医療研究所の研究フェローによって実証されました。
結論
- この方法は、疾患のコンテキストにおける筋再生の理解を深めます。
- 筋生物学を研究する研究者に貴重なツールを提供します。
- 将来の応用により、筋疾患の治療戦略の改善につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, cost-effective quantification of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease, supporting target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery. By providing reproducible birefringence-based readouts, it facilitates predictive confidence in assessing therapeutic interventions for muscle wasting conditions. The approach aligns with early discovery workflows requiring scalable, quantitative phenotypic screening to prioritize lead candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying muscle regeneration as a functional readout of stem cell activity in disease models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized injury and imaging protocols that reduce variability in regenerative potential assessment.
- Predictive Value: The regenerative index calculation allows comparative analysis across genotypes, aiding in target confidence and portfolio triage for muscle disease targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (normalized birefringence intensity) that enable objective comparison of muscle repair across conditions.
- Operational Value: The DNA extraction chip platform supports assay standardization and reproducibility across large embryo cohorts, facilitating screening readiness.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound evaluation in muscular dystrophy and aging models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Leverages the high conservation of zebrafish muscle regeneration with mammalian systems to support disease-relevant target validation.
- Mechanistic De-risking: Enables identification of impaired stem cell function and niche contributions, informing downstream cellular and molecular analysis of disease mechanisms.
- Preclinical Model Utility: Provides a disease-relevant system for assessing regenerative outcomes prior to therapeutic intervention studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical assessment, enabling go/no-go decisions based on regenerative potential in muscle disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of muscle stem cell function and pathway clarification in muscular dystrophy and aging contexts.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized injury, imaging, and birefringence quantification for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts (area, mean birefringence, normalized intensity, regenerative index) that enable cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via disease-relevant muscle regeneration readouts in Lama2 models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and imaging pipeline applicable across multiple muscle disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative assessment of muscle regeneration in vivo.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of genotyping and injury protocols across 96-well compatible formats.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in muscle regeneration programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on regenerative index outcomes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and polarized light microscopy for birefringence measurement.
- Dependent on genotyping platform, DNA extraction chip, and image analysis software for polygon-based region quantification.
- Necessitates cross-team standardization of injury parameters (somite selection, needle gauge, depth) and incubation conditions for reproducible results.
- Adaptation considerations include model-specific injury response variability and baseline birefringence differences in diseased versus wild-type muscle.
- Practical limitations include dependency on accurate genotype assignment prior to injury and the need for blinded analysis to minimize scoring bias.
