中枢神経系の In Vivo 髄鞘再形成研究のための浸透圧ポンプベースの薬物送達

脱髄は、複数の中枢神経系疾患において起こる。信頼性の高い インビボ 薬物送達技術は、薬物試験を再髄するために必要である。このプロトコルは、脳実質への長期的な薬物送達を直接可能にし、薬物バイオアベイラビリティを改善し、髄鞘再形成研究に広く適用する浸透圧ポンプベースの方法を記述している。

浸透圧ポンプは、ミエリン再生の研究、特に半減期が短く、血液脳関門透過性が低く、様々な末梢副作用を有する薬物にとって大きな価値がある。浸透圧ポンプは、血液脳関門をバイパスし、脳梁に直接薬物を送達することができ、これは、特に半減期が短いいくつかの薬物について、薬物の生物学的利用能を効果的に改善する。まず、麻酔をかけられたマウスの頭を、歯の棒とイヤーバーで定位装置に固定します。

手術部位を除いて動物の体を覆う。メスを使用して、頭蓋骨を露出させるために、首の付け根から目の間まで皮膚の長さ1センチメートルの中間矢状突起切開を行う。過酸化水素30%を含む綿棒を使用して、頭蓋骨の表面を優しく拭き取り、頭蓋構造を視覚化します。

歯のバーとイヤーバーの高さを調整して、ラムダポイントとブレグマポイントを同じ高さに配置します。10マイクロリットルと33ゲージのシリンジ針の先端をブレグマポイントにそっと置き、X、Y、Z座標をゼロにリセットします。シリンジを注射部位に移動します。

1マイクロリットルの26ゲージと0.45ミリメートルのシリンジ針で硬膜を貫通することなく、注射部位の頭蓋骨に小さなバリ穴をゆっくりと開けます。マイクロリットルの注射針を、一定の深さに達するまで、穴を通して脳組織にゆっくりと挿入する。1.5マイクロリットルの1%リゾレシチンを毎分0.5マイクロリットルの速度で注入する。

シリンジを引き抜く前に5分間待ってから、5-0の外科用縫合糸で皮膚を縫合する。手術を受けたマウスを単独でケージに入れ、手術後は毎日マウスを監視します。組織接着剤で脳注入カニューレの針に3つの深さ調整スペーサーを取り付け、脳梁に近い1.5ミリメートルの注射深さを達成する。

ポンプパッケージ付きのシリンジ針を1ミリリットルのシリンジに取り付けて浸透圧ポンプを満たし、薬物を吸引する。ポンプを直立姿勢で保持します。ポンプ上部の開口部にシリンジを挿入し、気泡を発生させずにゆっくりと薬物を注入する。

液体が開口部から流れ出るので、ゆっくりとシリンジを引き抜きます。はさみまたはペンチを使用して、フローレギュレータから白いフランジを取り外します。フローモデレーターをポンプに挿入します。

浸透圧ポンプに気泡があるかどうかを判断するには、充填の前後に浸透圧ポンプを別々に計量します。動物の大きさに応じて必要な長さにカテーテルをトリミングします。カテーテルを脳注入カニューレに取り付けます。

空気を導入せずにシリンジを使用してカテーテルに薬物を充填する。カテーテルをフローモデレータに接続して、露出したフローモデレータの約4ミリメートルをカバーするようにします。充填したポンプを摂氏37度の滅菌0.9%生理食塩水またはPBSに少なくとも4〜6時間浸漬する。

実装後に一晩延長することを好みます。マウスを再び定位装置上に固定する。以前に縫い付けた外科的切開を開き、切開部を肩甲骨まで広げる。

止血ペンチまたはピンセットを使用して肩甲骨の皮下結合組織から皮膚を分離して空洞を開き、浸透圧ポンプを空洞に入れる。綿棒で、脱髄モデルを確立するときに作成された頭蓋骨の表面のピンホールを優しく拭き取り、露出させます。脳注入カニューレをピンホールに垂直に挿入し、組織接着剤で頭蓋骨に固定します。

脳注入カニューレの上にある取り外し可能なタブをハサミで取り外します。切開部を縫い合わせるか、組織接着剤で取り付けます。手術後、動物をケージに一人で入れます。

実施後DAPI染色を行ったところ、脳組織のピンホールが白質の真上にあることが明らかになり、浸透圧ポンプの脳内注入カニューレの実装に成功したことを示している。成熟希突起膠細胞マーカーMAGプローブを用いてin situハイブリダイゼーション実験を行い、新たに分化した希突起膠細胞を標識した。結果は、UM206処理が対照群よりも脱髄領域においてより多くのMAG陽性細胞を産生することを示した。

脱髄領域の透過型電子顕微鏡観察は、UM206処置群において対照群と比較して有髄軸索の数が増加したことを示し、UM206がより高いレベルの再髄化を誘導したことが示唆された。浸透圧ポンプを準備するときは、システムに気泡を導入しないように注意してください。