Name: 土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶ土壌からの酵母・カビ分離法。多様な気候地域の土壌サンプルを用いて、1週間で培養酵母とAspergillus fumigatusを効率的に分離する方法です。環境中の酵母多様性と病原性リスクの評価に役立ちます。

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この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会からの助成金(Grant No.ALLRP 570780-2021)およびマクマスター大学。

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<li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li>
<li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li>
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<li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST+%C2%AE+Command+Line+Applications+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22National+Center+for+Biotechnology+Information%22%5BJournal%5D)">BLAST ® Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li>
<li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li>
<li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19(2021).</li>
<li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li>
<li>Wang, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li>
</ol>

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

土壌から酵母および A.フミガーツス を単離するために開発されたプロトコルは、ハイスループット土壌処理および真菌単離のための迅速かつ効率的な方法である。このプロトコルは、サンプルあたり少量の土壌(0.1〜0.2g)しか必要としないため、同様の努力でより多くのサイトをサンプリングすることができます。迅速なターンアラウンドタイムにより、短い時間枠内で結果が得られ、必要に応じてトラブルシューティングや実験の繰り返しに時間をかけることができます。このプロトコルは、標準的な微生物学および細胞培養装置を使用して、多くの実験室環境で簡単に複製できます。ただし、酵母やカビを国際土壌から隔離する場合は、特別な予防措置が必要です。プラスチックトレイやセルスプレッダーなどの使い捨てでないプラスチック機器はすべて、10%漂白剤に浸してからオートクレーブ処理することで滅菌する必要があります。使用済みのベンチコートは、廃棄する前にビニール袋に密封し、オートクレーブで滅菌する必要があります。
なお、上記のプロトコールを用いて単離された酵母の数および同一性は、使用するインキュベート条件および培地...

土壌生態系の菌類は、有機物の分解、栄養循環、土壌施肥に重要な役割を果たしています1.培養非依存性(すなわち、ハイスループットシーケンシング)および培養依存性アプローチの両方が、土壌真菌の研究において広く使用されている2,3。ハイスループットメタバーコードシーケンシングによって生成される大量のデータは、群集構造と多様性の広範なパターンを解明するのに有用であるが、培養依存的アプローチは、真菌群集の分類学的および機能的構造に関する高度に補完的な情報、ならびに純粋な真菌培養物の利用可能性による下流の多様性および機能解析を通じて個々の生物のより具体的なプロファイルを提供することができる。
土壌1グラムあたり数千の細胞を超えることはめったにないにもかかわらず、単細胞菌類として広く定義される酵母は、他の土壌居住者にとって不可欠な分解剤および食物源である4,5。実際、酵母は、大陸南極大陸などの寒い生物圏における優勢な土壌真菌であり得る6,7。土壌はまた、ヒトおよび他の哺乳動物において重篤な日和見感染を引き起こす医学的に関連する酵母の主要な貯蔵庫である8。形態学的類似性にもかかわらず、酵母種は系統学的に多様であり、真菌界内の2つの主要な門、子嚢菌と担子菌の糸状菌の間で発生する9。酵母は、核リボソームRNA遺伝子クラスター10の内部転写スペーサー(ITS)領域である真菌バーコード遺伝子に明確なDNAシグネチャを欠いているため、メタゲノミクス調査において他の真菌と区別がつかないため、酵母種を単離するために培養依存的な方法を使用する必要があります。
以下のプロトコルは、9カ国の土壌酵母コミュニティを特徴付け、土壌酵母の多様性における世界的な傾向とパターンを特定するために実施されました9,11,12。メタゲノミクスアプローチは、酵母2,3などの生物の標的群を研究する際には、限られた用途しかない。その系統学的多様性のために、酵母はDNA配列のみに基づいて他の真菌と区別することができない。したがって、酵母集団を研究するには、培養依存的単離の継続的な使用が必要である。しかし、培養はしばしば著しく時間がかかり、実験を行うためにより多くの人員を必要とする。したがって、プロトコルは最適化および合理化されており、限られた人員でより高速に処理できます。培養の主な利点は、同定された酵母種が生きた酵母であり、死んだ酵母ではないことであり、したがって、土壌中に存在する一過性の細胞ではなく、真の土壌居住者である可能性が高いことである。土壌中の真菌DNAの約40%は、他の環境、細胞外からの汚染物質、またはもはや無傷の細胞からの汚染物質であると推定されており、真菌の豊かさを55%も過大評価するハイスループットシーケンシングアプローチを引き起こしています13。培養依存性の単離は、酵母種の同一性を容易に確認することができ、下流の分析に使用する純粋な培養物を確保するという追加の利点がある。実際、44種の推定される新しい酵母種の純粋な培養物が、分類学的および機能的特性を詳細に研究するためのさまざまな方法の使用を可能にしたこの土壌単離プロトコルを使用して同定された14。
以下のプロトコールは、A. fumigatusなどの土壌内に存在するカビを単離するためにも使用することができる。アスペルギルス フミガーツスは、土壌15に広く全球的に分布する好熱性および腐生性のカビです。それは多数の臨床的および非臨床的環境から単離されている。非臨床サンプリングには、一般に、空気、有機破片(堆肥、のこぎり粉、チューリップ球根廃棄物)、土壌(農業、庭園、天然土壌)が含まれます16,17,18,19。アスペルギルス フミガーツスは、アスペルギルス症と総称される一連の感染症を引き起こすヒト日和見病原体であり、世界中で800万人以上に影響を与えています16,20。世界中の約300,000人が侵襲性アスペルギルス症に罹患しており、これは最も重篤な形態のアスペルギルス症である16。患者集団、感染部位、抗真菌療法の有効性などの要因に応じて、死亡率は90%にもなる可能性があります。過去数十年にわたり、抗真菌療法に対する耐性が増大しており、これらの耐性遺伝子型を追跡するために、臨床的および環境的集団の両方における世界的なサーベイランス努力が必要である21,22,23。50°C以上の温度で増殖する能力を考えると、この温度を利用して、培養依存的な方法を使用して土壌からA. fumigatus分離株を選択することができます。アスペルギルス フミガーツス分離株は、一般に、9つの高度に多型的な短いタンデムリピート(STR)遺伝子座で遺伝子型決定され、株24間で高い識別力を有することが示される。これらのSTR遺伝子型は、以前に調査された他の集団と比較して、薬剤耐性遺伝子を含むA. fumigatus遺伝子型の世界的な広がりを追跡することができる。
以下に、培養依存的な方法で土壌サンプルから酵母およびA. fumigatusを迅速に単離するためのプロトコルを記載する。サンプルごとに得られる土壌の量に応じて、土壌サンプルを2つのプロトコル間で共有することができます。酵母およびA.フミガーツスを土壌から単離する同様の方法と比較して、このプロトコルは、得られた単離物当たり10倍少ない土壌を使用する。土壌からA. fumigatusを単離しようとする研究は、単離物あたり1〜2gの土壌を必要とするが、このプロトコルは0.1〜0.2gの土壌18,19,25しか必要としない。このプロトコルは、ハイスループット設計を容易にする小型のプラスチックと容器を利用しています。したがって、インキュベーターやローラードラムなどの機器用のスペースを少なくして、より多くのサンプルを処理できます。土壌サンプルは、わずか7日で分離株を得るために完全に処理することができます。このプロトコルは、1人あたり1日あたり最大150〜200サンプルの処理を可能にするように最適化されています。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL微量遠心チューブ</td><td>Sarstedt Inc</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>ベノミル粉末&nbsp;</td><td>トロントリサーチケミカルズ</td><td>B161380</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール粉末&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SKU: C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SKU: D9434-500G</td><td></td></tr><tr><td>フラグメント解析ソフトウェア</td><td>NCBIのオシリス</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td></tr> <tr><td>ITS配列データベース</td><td>NCBI GenBank&nbsp;</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td></tr> <tr><td>ITS配列データベース</td><td>UNITE&nbsp;</td><td></td><td>https://unite.ut.ee/</td></tr> <tr><td>ペプトン</td><td>Sigma-AldrichSKU</td><td>:P5905-500G</td><td></td></tr><tr><td>再利用可能なセルスプレッダー&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-100-12</td><td></td></tr><tr><td>滅菌直径10cmのシャーレ&nbsp;</td><td>Sarstedt Inc</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 13 mL 培養チューブ&nbsp;</td><td>Sarstedt Inc</td><td>62.515.006</td><td></td></tr><tr><td>木製のプレーンチップアプリケータースティック&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-400-112</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Sigma-AldrichSKU</td><td>:Y1625-250G</td><td></td></tr></tbody></table>

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

土壌は信じられないほどの量の微生物の生命をホストしており、各グラムには数十億の細菌、古細菌、真菌細胞が含まれています。カビや単細胞菌などの多細胞菌類は、広く酵母として定義され、有機物の分解者として、また他の土壌住民の食料源として、土壌生態系において不可欠な役割を果たしています。土壌中の真菌種の多様性は、降雨量や気温などの多数の気候要因、ならびに有機物、pH、水分などの土壌特性に依存する。特にアジア、アフリカ、南米、中央アメリカの地域では、適切な環境サンプリングの欠如は、土壌真菌群集の特徴付けと新種の発見を妨げている。 
我々は、約4,000の土壌サンプルと、酵母とカビの単離のために実験室で開発されたプロトコルを使用して、6大陸の9カ国の土壌真菌群集を特徴付けた。このプロトコルは、細菌の増殖を抑制しながら、酵母および医学的に関連するカビ であるアスペルギルス フミガーツスを液体培地中で別々に選択的に濃縮することから始まります。次いで、得られたコロニーを固体培地に移し、さらに処理して純粋な培養物を得、続いて下流の遺伝子特性評価を行う。酵母種の同一性は、核リボソームRNA遺伝子クラスターの内部転写スペーサー(ITS)領域のシーケンシング によって 確立され、 A. fumigatus の全球集団構造はマイクロサテライトマーカー分析 によって 探索される。 
このプロトコルは、カメルーン、カナダ、中国、コスタリカ、アイスランド、ペルー、ニュージーランド、サウジアラビアの土壌酵母および A. fumigagatus 集団を単離し、特徴付けるために首尾よく適用されました。これらの知見は、土壌酵母の多様性における地球規模のパターン、ならびに A. fumigatusの世界的な集団構造および抗真菌性プロファイルに関する非常に必要な洞察を明らかにした。本稿では、国際的な土壌サンプルから酵母と A. fumigatus の両方を単離する方法を提示する。

土壌からの酵母の単離 上記の酵母単離プロトコルは、9、12の9カ国の53カ所を起源とする土壌サンプルから酵母を培養するために実施された。合計で、1,473の酵母株が3,826の土壌サンプルから単離された。9つの出発国の異なる気候条件を考えると、各国の最良の孵卵温度は、その年間平均気温に基づいて決定された(表1)。14°Cでの酵母増殖が遅いことを考えると、アイスランドからの土壌サンプルをローラードラム上でさらに48時間(合計96〜120時間)インキュベートした。固体培地上での2〜3日間のインキュベーションに続いて、微生物増殖がすべてのサンプルについてプレート上で見えた(図1A)。プレート上に存在する酵母形態ごとに無作為に選択されたコロニーを、新鮮なプレート上の単一コロニーについて筋状にした(図1B)。
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このプロトコルは、わずか7日間で大量の土壌サンプルから酵母とカビ アスペルギルス フミガーツス を培養する効果的で迅速な方法です。この方法は、実験に必要なさまざまなインキュベーション培地と温度に対応するように簡単に変更できます。

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

私たちのプロトコルは、異なる気候地域から得られた土壌サンプルを使用して、土壌中の酵母とカビの多様性を調査します。これは、環境酵母の多様性に関する洞察を提供し、病原性種の追跡に役立ちます。このプロトコルは、土壌から酵母やカビを収穫する費用対効果の高い迅速な方法を提供します。土壌サンプルは、わずか7日で分離株を得るために完全に処理することができます。培養チューブにラベルを付け、培地を1日前に準備するなど、よく組織された実験セットアップは、実験中に圧倒される感覚を避けるための鍵です。滅菌13ミリリットル培養チューブのセットを準備することから始めます。土壌サンプルIDでそれらを標識することによって、血清学的ピペットを使用して、クロラムフェニコールおよびベノミルを添加した酵母エキス - ペプトン - デキストロースブロス5ミリリットルを各チューブに加える。レベル2の生物用のバイオセーフティキャビネット内で、滅菌木製の平面先端アプリケーターを使用して、約0.1グラムの土壌を適切な培養チューブに移します。チューブを最初のストップにしっかりとキャップし、インキュベーション中の空気交換を可能にしながらこぼれを防ぎます。次に、培養チューブをローラードラム中で、酵母増殖を最大化するのに最適と考えられる温度で24時間インキュベートする。次いで、クロラムフェニコールおよびベノミル添加酵母エキスペプトンデキストロース寒天プレートを、上清を固体培地に移す前に土壌サンプルIDで標識する。ローラードラムから培養チューブを取り外します。次に、レベル2の生物用のバイオセーフティキャビネット内で、チューブを短時間渦巻きにして、底に沈んだ可能性のある土壌粒子と細胞を懸濁液に戻します。次に、上清100マイクロリットルをマイクロピペットを用いてプレート上に移す。滅菌再利用可能なセルスプレッダーを使用して、液体を寒天表面に完全かつ均等に広げます。2〜3日の十分なインキュベーション時間を確保した後、レベル2の生物のバイオセーフティキャビネット内の酵母増殖についてプレートを検査します。クリーミーで丸みを帯びたマット状の酵母で、細菌やカビのコロニーと簡単に区別できます。滅菌された木製の平らな先端のアプリケータースティックを使用して、各プレートから酵母様のコロニーを1つ選択します。選択した各コロニーを、単一コロニー用のクロラムフェニコールとベノミルとストリークを添加した新鮮な酵母エキスペプトンデキストロ寒天プレートに移します。3つの別々のスジを実行し、すべてのスジに新しいアプリケータースティックを使用します。次に、プレート上で展開した新鮮な細胞を用いてコロニーポリメラーゼ連鎖反応を行う。内部転写スペーサーITS1およびITS4プライマーを使用して、真菌バーコード遺伝子を増幅する。得られた酵母株の内部転写スペーサー

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生物学

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土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

学ぶ土壌からの酵母・カビ分離法。多様な気候地域の土壌サンプルを用いて、1週間で培養酵母とAspergillus fumigatusを効率的に分離する方法です。環境中の酵母多様性と病原性リスクの評価に役立ちます。

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

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