モルモットの目からの網膜色素上皮細胞の分離

網膜色素上皮またはRPEは、網膜の健康にとって重要です。そして、単離されたRPEを研究することは、網膜疾患にとって非常に重要です。人気のある近視モデルであるモルモットからのRPE分離のこの方法は、困難な問題の解決に役立ちます。

この技術の主な利点は、RPE分析を含む生物学的分子研究に適した比較的簡単で高品質のRPEサンプルが得られることです。実証されたテクニックに完全に従い、解剖ツールの操作方法を観察することで、ある程度の練習でこの手順をすばやく習得できます。モルモットを人道的に安楽死させ、動物の目を切除した後、滅菌リン酸緩衝生理食塩水またはPBSを含む10センチメートルのペトリ皿に移して直ちに目を洗います。

洗浄後、目を新鮮なPBS溶液に移します。現在、解剖顕微鏡で作業している18ゲージの針を使用して、角膜と強膜の間の辺縁境界の約1ミリメートル後ろにある片目の強膜に最初の小さな開口部を作ります。はさみを使用して、角膜、虹彩、毛様体、水晶体などの前部を取り除きます。

次に、残りの後眼部で作業し、鉗子を使用してジン小帯をつかんで優しく引っ張り、続いて網膜をRPE /脈絡膜/強膜複合体から剥離し、断片化せずに網膜を剥がします。網膜が完全に除去されたら、RPE、脈絡膜、強膜を含む残りの後眼カップを、2ミリリットルの組織保存試薬を含む12ウェルプレートのウェルの1つに浸し、5分間浸したままにします。保存試薬を洗い流すには、アイカップを4ミリリットルのPBSで満たされた別のウェルに10秒間移してから、2ミリリットルのPBSで満たされた3番目のウェルに移動します。

最後のRPE分離ステップに進む前に、PBSで満たされた1ミリリットルのシリンジを準備し、30ゲージの針を取り付けます。シリンジプランジャーをそっと押して、PBSのジェットストリームを作成します。顕微鏡下で作業し、まず、このPBSの流れをRPEに向け、小さな裂け目や穴を開けます。

次に、PBSのストリームを作成した開口部に向け、RPEをシートとして脈絡膜から切り離します。脈絡膜からRPEを剥離した後、RPE細胞を針のない1ミリリットルのシリンジに集め、採取したサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。回収したRPEでチューブを8, 000 x gで1分間遠心分離し、RPEペレットを得た。

RNA分析に使用するサンプルの場合は、上清、つまりPBS溶液を廃棄し、RNA分離キットに含まれている350ミリリットルの溶解バッファーと交換してください。内容物を20回上下にピペットして、よく混合し、サンプルの品質を維持します。長期保存と保存のために、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に移します。

RNA分離キットを使用し、製造元の指示に従ってRPEサンプルからRNAを分離および収集してから、電気泳動でサンプルの品質を評価します。私たちの研究では、収集されたRPEサンプルは、RNA完全性数またはRINが8を超えるよく保存されたRNAを示しました。総RNA数は片目あたり約240ナノグラムです。

RPE特異的遺伝子Rpe65の発現量は、脈絡膜および強膜よりもRPEサンプルで有意に高いことがわかった。対照的に、RPEサンプルは、選択された脈絡膜強膜特異的遺伝子、コラーゲンタイプα-oneの最小発現を示し、単離されたRPEサンプル中に脈絡膜および強膜汚染物質が存在しないことを示しています。手順の最も重要なステップは、網膜断片を残さずに網膜をスムーズに除去することです。

このRPE単離手順は、単離後にRPE細胞を浸漬するための培地の選択など、いくつかの重要な違いがあるin vitro細胞培養研究の説明を保証します。