成体ショウジョウバエメラノガスターにおける化学毒性の評価

このプロトコルは、ショウジョウバエを化学物質安全性試験の標準モデルとして確立し、一般にNAMと呼ばれる新しいアプローチ方法論を開発するための重要なステップを表しています。このプロトコルは、液体媒体を利用して、成虫ショウジョウバエメラノガスターの生存率に対する化学毒物の影響を評価する効率的で安価な方法を説明しています。まず、グレード1のセルロースクロマトグラフィー紙を4枚積み重ね、幅2インチのストリップにカットします。

花の形の染料を含む1.5インチのペーパーパンチを使用して、花の形のろ紙インサートを打ち抜きます。22 x 220ミリメートルのニスを塗っていない木製ダボを使用して、直径28.5ミリメートルのポリプロピレンバイアルの底にろ紙のスタックを押し込みます。スタックがバイアルの底にしっかりと配置されていることを確認します。

準備したバイアルをプラスチックまたは段ボールのトレイに保管し、使用するまでトレイを大きなビニール袋に入れます。ハエが入っているガラスバイアルを開き、準備したプラスチックバイアルの口の上に置き、プラスチックバイアルの底をベンチトップに軽くたたくことによって、選別された性別に一致するハエを飢餓バイアルに移します。セルロースアセテートプラグまたはフラッグでプラスチックバイアルを閉じ、この転送で失われたハエを記録します。

雌のハエを含む飢餓バイアルに縞模様の印を付けます。偶発的な混合を避けるために、メールハエの入ったバイアルにはマークを付けないでください。底に6枚の標準的なペーパータオルを置いて、一晩さらすための湿度チャンバーを準備します。

次に、ペーパータオルを100ミリリットルの水に浸し、濡れたタオルの上にプラスチックグリッドを置き、バイアルが飽和したペーパータオルに接触しないようにします。飢餓バイアルのトレイを湿度チャンバー内の水平位置に置いた後、湿度チャンバーを摂氏25度のインキュベーターに移して一晩インキュベートします。化学暴露バイアルを準備するには、バイアルあたり20匹のハエを含む飢えた雌のハエの4つのバイアルを、各化学物質濃度の4つの曝露バイアルに移します。

これらのバイアルに女性としてラベルを付けます。.飢えた雌のハエのバイアルを各化学物質濃度の青い暴露バイアルに移すことによって、青色染料を含む化学物質暴露バイアルを準備します。このバイアルに女性としてラベルを付けます。

転送後に各バイアルに存在するハエの数を記録し、死亡または脱出した数をメモします。通常、20匹のハエはすべて一晩の飢餓と移動を生き残るはずです。暴露バイアルを新たに準備した湿度チャンバーに水平に置いてから、チャンバーを湿度約60%の摂氏25度のインキュベーターに入れ、12〜12時間の明から暗のサイクルです。

化学物質暴露の開始から24時間後および48時間後に暴露バイアルを調べます。各時点で各バイアル内の死んだハエを数えて記録します。暴露されたハエが化学物質への暴露の24時間後に青い暴露バイアル内の青い暴露媒体を消費したかどうかを判断するには、暴露バイアルとフラッグの側面に小さな点として現れる青い糞の兆候がないかバイアルの壁を調べます。

次に、腹部に青い染料が存在するかどうかを調べる前に、二酸化炭素を使用してハエを麻酔します。逆流、作物の膨張、腸管バリア機能の崩壊などの異常な摂食行動がないかハエを調べます。完了したら、汚染されたすべてのバイアル、ろ紙、プラグ、ハエを適切な化学廃棄物容器に廃棄します。

生きたハエがバイアルに残っている場合は、適切な廃棄物容器に廃棄する前にバイアルを凍結してください。プロトコルの有効性は、成体臓器またはオスとメスのハエを0〜2ミリモルのナトリウムアルソナイト濃度の範囲に曝露して、48時間の曝露後の致死率をスコアリングすることによって決定されました。その後の実験では、ナトリウム褐亜鉛塩用量反応曲線をより正確に定義する0〜5ミリモル濃度が選択されました。.

このモデルに基づいて、ナトリウムアルソナイトを与えられたオスのハエの最終致死量またはLD 10、LD 25およびLD 50は、それぞれ0.30ミリモル、0.50ミリモルおよび0.65ミリモルであった。これらの値は、LD 10が0.30ミリモル、LD 25が0.65ミリモル、LD 50が0.90ミリモルの雌バエでわずかに高かった。1%F DおよびC blue含有ナトリウムアルソナイト溶液を与えられたオスおよびメスのハエでは、摂取された食物は、メスで0.2ミリモル、オスで0.5ミリモルを超える用量で逆流することがあり、逆流がヒ素中毒に対するドロスフィリア応答に重要な役割を果たす可能性があることが示唆されました。

この曝露プロトコルに従うと、ハエはゲノムおよびメタボロミクス研究を含むさらなる分析のために簡単に収集できます。このプロトコルは、ショウジョウバエを精密毒物学の大規模な研究を行うための共通の遺伝子モデルとして確立するための最初のステップです。