Name: GFPベースのレポーターシステムを用いたHEK-293T細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶHEK-293T細胞におけるDNA二重鎖切断修復効率の評価法。GFPベースのエキストラクロモソームNHEJ・HRアッセイにより、流式細胞計測で非相同末端結合と相同組換えを迅速に定量し、修復メカニズムの解析に活用する。

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本研究は、中国黒竜江省自然科学基金会(YQ2022C036)と七七春医科大学大学院イノベーション基金会(QYYCX2022-06)の助成を受けて行われました。図 1 は MedPeer を使用して作成されています。

1. プラスミドの単離
<ol><li>コンピテント 大腸菌 をプラスミドEJ5-GFP、DR-GFP、pCBASceI(I-SceI発現プラスミド)、およびPCI2-HA-mCherry(mCherry発現プラスミド)( 材料表を参照)で、標準形質転換プロトコル20に従って形質転換します。 注:PCI2-HA-mCherryは、他のmCherryまたはDsRed発現プラスミドで置換できます。</li>
	<li>形質転換 した大腸菌 を、100 μg/mL アンピシリンを添加した 500 mL の液体 LB 培地で 37 °C で一晩振とうしながら培養します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、市販のエンドトキシンフリープラスミドマキシ単離キットを使用してプラスミドを単離します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>ナノ滴微量分光光度計を使用してプラスミド濃度を定量化します。プラスミド濃度を1 μg/μLに調整します。</li>
</ol>2. 細胞調製とトランスフェクション
<ol><li>HEK-293T細胞をDMEM培地で培養し、10%ウシ胎児血清を添加します。HEK-293T細胞または確立されたHEK-293T安定細胞が良好な増殖状態にあることを確認してください。 注:凍結細胞は、トランスフェクションの前に少なくとも2回の分裂を受ける必要があります。</li>
	<li>トランスフェクションの前日に、HEK-293T細胞を6ウェルプレートで2×105 細胞/ウェルに播種し、翌日に約60%のコンフルエントを達成します。</li>
	<li>トランスフェクション当日は、細胞の密度を確認し、約60%を目指します。NHEJアッセイでは、製造元の指示に従って市販のトランスフェクション試薬を使用して、1 μgのEJ5-GFP、1 μgのpCBASceI、および1 μgのPCI2-HA-mCherryプラスミドを6ウェルプレートにトランスフェクションします( 材料表を参照)。HRアッセイでは、EJ5-GFPプラスミドをDR-GFPプラスミドに置き換えてください。</li>
	<li>FACSキャリブレーションコントロールの場合、ネガティブコントロールとしてトランスフェクションされていない細胞のウェルを残します。(1)1 μgのEJ5-GFP(NHEJアッセイ用)または1 μgのDR-GFP(HRアッセイ用)と、GFP単色コントロールとして1 μgのpCBASceI、または(2)1 μgのPCI2-HA-mCherryをmCherry単色コントロールとして、6ウェルプレート中の細胞をトランスフェクションします。</li>
</ol>3. フローサイトメトリーによるGFP陽性細胞とmCherry陽性細胞の解析
<ol><li>トランスフェクションの2日後、蛍光顕微鏡を用いてGFPおよびmCherryタンパク質の発現を確認します。</li>
	<li>トランスフェクションの3日後、培地をウェルから取り出し、PBSで1回洗浄し、各ウェルに500 μLのトリプシンを加えます。37°Cで5分間インキュベートし、プレートからすべての細胞を剥離します。このステップとその後のステップ全体で、細胞を直接光から保護します。</li>
	<li>500 μLの完全DMEM培地を各ウェルに加え、細胞を再懸濁して、凝集物が見えないようにします。</li>
	<li>各ウェルのすべての細胞を1.5 mLの遠心チューブに移し、次に室温で1000 × g で2分間細胞を遠心分離します。</li>
	<li>ピペッティングで上清を慎重に取り除き、1.0 mLのPBSで一度洗浄します。</li>
	<li>再度、ピペッティングで上清を慎重に除去し、細胞を500μLのPBSに再懸濁し、細胞をFACSチューブに移します( 材料の表を参照)。 注:最適な結果を得るには、細胞採取後すぐにフローサイトメトリー解析を開始してください。あるいは、細胞を氷上に数時間保存することもできます。</li>
	<li>トランスフェクションされていない細胞(ネガティブコントロール)、EJ5-GFP/DR-GFP、およびpCBASceIトランスフェクションされた細胞(GFP単色コントロール)およびmCherryトランスフェクションされた細胞(mCherry単色コントロール)でFACSを較正します。GFPとmCherryの間の蛍光のスピルオーバーを最小限に抑えるために、電圧と補償を調整します。</li>
	<li>各チューブから少なくとも 10,000 個の無傷の細胞を取り込み、記録します。</li>
</ol>4. データ分析
注:次の手順は、FlowJoソフトウェア( 資料表を参照)を使用してFACSデータを分析するために実行されます。同等の手順を代替解析ソフトウェアで実行できます。
<ol><li>すべてのFACSファイルをダッシュボードにドラッグします。ファイルの1つをダブルクリックして、FSC/SSCプロットを表示します。</li>
	<li>ポリゴンゲートを作成して、左下隅の破片を除いた無傷のセルを選択します。このサブポピュレーションに「Intact Cells」という名前を付け、このゲートを「All Samples」バーにドラッグします。 Next Sample ボタンを使用して各サンプルをスクロールし、各サンプルに適切なゲートがあることを確認します(図2A)。</li>
	<li>ネガティブコントロールサンプル(トランスフェクションされていない細胞)の Intact Cells サブポピュレーションをダブルクリックして、新しいプロットを表示します。軸を FL1-H (x軸、GFP)、FL2-H(y軸、mCherry)に変更します。</li>
	<li>クワッドゲーティングツールを選択し、ネガティブセル集団の右上端をクリックします(図2B)。4 つの長方形のゲートを [Intact Cells] バーにドラッグします。「Next Sample」ボタンを使用してGFP単色コントロールまたはmCherry単色コントロールのサンプルをスクロールし、GFP陽性またはmCherry陽性のコントロール細胞とネガティブコントロール細胞を区別するための適切なゲーティングを確保します(図2C、D)。必要に応じて象限ゲーティングを微調整し、このゲーティングをすべての「Intact Cells」集団に適用します。</li>
	<li>レイアウトエディタをクリックします。代表的なプロットを右クリックし、[Copy to Layout Editor]を選択します。代表的なプロットをすべて選択し、ダブルクリックしてグラフ定義を開きます。必要に応じて、軸のラベル、注釈、および凡例を調整します。</li>
	<li>実験サンプル中のmCherry陽性細胞の割合は、トランスフェクション効率の制御として機能します。同じプロット内のGFP陽性細胞の数とmCherry陽性細胞の数を比較することにより、相対的なDNA修復効率を計算します。</li>
</ol>

NHEJおよびHR効率を評価するためのGFPおよびmCherryレポーター細胞のFACS分析

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

開示すべき利益相反はありません。

ここで述べる方法は、NHEJ効率およびHR効率を評価するためにいくつかの論文で採用されている9,10,11,12,13,14,16,17,18,19。この方法は、DNA DSB修復の根底にあるメカニズムを解明し、NHEJおよびHRに関連する新しい因子を特定するのに適しています。例えば、DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット(DNA-PKcs)9、コイリン相互作用核ATPアーゼタンパク質(hCINAP)10、WASH11、レチノイン酸誘導性遺伝子I(RIG-I)12、X線修復交差補完タンパク質4(XRCC4)12、HORMAドメイン含有タンパク質1(HORMAD1)13、ユビキチン特異的プロテアーゼ44(USP44)14の機能、および nncRNA NIHCOLE (肝細胞癌に誘導され、結紮効率に発癌性の役割を持つノンコーディング RNA) は、染色体外法の適用を通じて明らかにまたは検証されています。染色体統合アプローチとは対照的に、この染色体外アプローチでは、確立された安定した細胞株を利用することで、NHEJまたはHRの効率を迅速に分析できます。
染色体外NHEJおよびHRアッセイは、以前に我々や他の研究者によってHEK-293T細胞で利用されてきた10,11,12、U2OS細胞16,17、胚癌細胞17,19、HCT116細胞9、SUM159細胞13、HCC1143細胞13、MDA-MB-436細胞13、 SUNE1細胞14、Huh7細胞18、およびJHH6細胞18。ここでのプロトコールは、HEK-293T細胞で実施されるNHEJおよびHRアッセイの詳細な説明を提供します。HEK-293細胞の顕著なトランスフェクション効率を考慮すると、1 μgのEJ5-GFPまたは1 μgのDR-GFPと1 μgのpCBASceIの組み合わせは、6ウェルプレートで培養するHEK-293T細胞には適切であると考えられています。ただし、HEK-293T 9,16,17以外の細胞株ではトランスフェクション条件が異なる場合があるため、研究者はトランスフェクションを成功させるための正確な条件を細心の注意を払って決定する必要があります。
トランスフェクション前に必要な細胞のコンフルエンシーを達成することは、プロトコールにおいて極めて重要な手順です。細胞数が不十分または過剰になると、トランスフェクションの有効性が大幅に妨げられる可能性があります。細胞数が不十分な場合、トランスフェクション後の毒性が悪化し、DSB修復の正確な評価が妨げられます。さらに、EJ5-GFP/DR-GFP、pCBASceI、PCI2-HA-mCherry、およびトランスフェクション試薬の混合物の偏差が結果に影響を与える可能性があるため、1回の実験でプラスミドとトランスフェクション試薬を同じ組み合わせで使用することが重要です。
NHEJとHRに加えて、DSBを修復するための追加のメカニズムとして、オルタネートエンドジョイン(a-EJ)と一本鎖アニール(SSA)が特定されています。しかし、野生型細胞では、NHEJとHRがDSB修復の主要な経路であり、a-EJとSSAはこの点でわずかな貢献しか果たしていません。EJ5-GFPプラスミドを用いたNHEJアッセイは、NHEJとa-EJの両方のイベントを検出するため、NHEJとa-EJの両方を含むトータルNHEJのアッセイと見なすことができることは注目に値します5。a-EJの個別解析は、EJ5-GFPをEJ2-GFP18に置き換えることで簡単に行うことができます。同様のアッセイは、破壊されたGFPレポーターをhprtSAGFP21に置き換えることにより、SSAの修復効率を分析するためにも実施できます。

DNA二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も有害な形態であり、迅速に修復しないと、ゲノムの不安定性、染色体再配列、細胞老化、および細胞死につながる可能性があります1。非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの確立された経路は、DNA DSBへの対処における有効性が認められています2,3。HRは、DSB修復のためのエラーのないメカニズムと考えられており、姉妹染色分体の相同配列をテンプレートとして利用して、損傷したDNA分子の元の構成を復元します3。一方、NHEJは、テンプレート2に依存せずに壊れたDNA末端を結合するエラーが発生しやすいDSB修復経路です。
NHEJ アッセイと HR アッセイは、もともとメモリアル スローン ケタリングがんセンターの Jasin の研究室で開発された古典的な方法であり、NHEJ と HR の効率をそれぞれ定量化するために利用されました 4,5,6,7。これらのアッセイは、NHEJおよびHR 8,9,10,11,12,13,14に関連するメカニズムと因子を調査する上で重要な役割を果たします。どちらのアッセイも、I-SceIエンドヌクレアーゼによって誘導されるDSBの修復をモニターするために、EJ5-GFPとDR-GFPという2つの破壊されたGFPレポーターの実装に依存しています。NHEJアッセイではEJ5-GFPレポーターが、HRアッセイではDR-GFPレポーターが使用されています。各レポーターは、I-SceI誘導DSBが特定の修復経路によってのみ修復され、GFP発現カセットを修復できるように微妙に設計されています4,5。
NHEJアッセイおよびHRアッセイは、染色体統合アプローチまたは染色体外アプローチのいずれかを用いて実施することができる15,16。染色体統合アプローチでは、破壊されたGFPレポーターをゲノムに統合する必要があり、染色体コンテキスト内でのDSB修復の解析が可能になります6,15。しかし、このアプローチは長時間の細胞継代を必要とし、任意の染色体統合のために複数の細胞株を含む比較研究には適さず、固有の違いとは別に追加の交絡因子を導入します。このプロトコールでは、染色体外NHEJアッセイおよびHRアッセイについて説明し、破壊されたGFPおよびI-SceIプラスミドのHEK-293T細胞への一過性トランスフェクションと、それに続くフローサイトメトリー分析について説明します(実験ワークフローを図1に示します)。これらの非統合レポーターアッセイは、もともとJasinの研究室によってDNA鎖間架橋修復を研究するために報告され16、いくつかの研究室9,10,11,12,13,14,17,18,19(うち11を含む)によってNHEJ効率およびHR効率を評価するために採用されている11.これらの染色体外アプローチは、複数の確立された安定細胞株を含む比較研究におけるDSB修復の解析を容易にします。

<table><tbody><tr><td>6cm皿&nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>作業濃度:100 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>DH5&α;コンピテントセル</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid&nbsp; kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used</td></tr><tr><td>FACSチューブ</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>CLARK</td><td>FB25015</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V.10.1</td><td>Treestar</td><td></td><td>代替解析ソフトは、</td></tr><tr><td>HEK-293T細胞</td>の<td>細胞株の国立インフラ Resource</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>代替トランスフェクションリージェントは、</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>pCBASceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td>I-SceIを発現するプラスミド</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mCherry</td><td></td><td></td>を発現することができます<td>DsRedを含む代替プラスミドは、</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr>を使用することができます</tbody></table>。

gfpベースのレポーターシステムを用いたhek-293t細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

DNA二本鎖切断(DSB)は、最も危険なDNA病変であり、大量の遺伝情報の損失と細胞の死を誘発する可能性があります。これに対して、細胞はDSB修復に非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの主要なメカニズムを採用しています。NHEJとHRの効率を別々に定量化することは、それぞれに関連するメカニズムと要因を調査するために重要です。NHEJアッセイとHRアッセイは、それぞれの修復経路の効率を測定するために使用される確立された方法です。これらの方法は、DSBを誘導するエンドヌクレアーゼI-SceIの認識部位を持つ破壊された緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む、細心の注意を払って設計されたプラスミドに依存しています。ここでは、HEK-293T細胞にEJ5-GFP/DR-GFPプラスミド、I-SceI発現プラスミド、およびmCherry発現プラスミドを同時トランスフェクションする染色体外NHEJアッセイとHRアッセイについて説明します。NHEJおよびHR効率の定量的結果は、フローサイトメトリーでカウントされたGFP陽性細胞とmCherry陽性細胞の比率を計算することによって得られます。染色体統合アッセイとは対照的に、これらの染色体外アッセイは、複数の確立された安定細胞株を含む比較研究を行うのにより適しています。

NHEJおよびHR分析の精度を確保するためには、適切な報酬調整およびゲーティング戦略の実施が必要です。通常、530 nmフィルターを使用すると、mCherry蛍光はGFP検出器に現れません。しかし、細胞が非常に高いGFP発現を示す場合、575 nmフィルターを使用すると、GFP蛍光がmCherry検出器を汚染する可能性があります。これらの懸念に対処するために、ネガティブコントロール、GFP単色コントロール、およびmCherry単色コントロールのサンプルを、補正とゲーティング戦略の調整に使用しました。コントロールセルの典型的なFACS結果を 図2に示します。コンペンセーション調整とゲーティング戦略では、GFP陽性細胞の大部分を右下の象限に配置し(図2C)、mCherry陽性細胞の大部分を左上の象限に配置する必要があります(図2D)。
最終的な代表的なプロットを 図3A、Bに示します。I-SceIによるDSBの誘導に続いて、成功した修復イベントによりGFP遺伝子が再構成されます。したがって、GFP陽性細胞の割合は、DNA DSB修復効率とトランスフェクション効率に対応します。mCherry陽性細胞の割合は、トランスフェクション効率にのみ対応します。DNA DSB修復の相対効率は、GFP陽性細胞とmCherry陽性細胞の比率として計算できます(図3C)。
DNA修復におけるWiskott-Aldrich症候群タンパク質およびSCARホモログ(WASH)の役割を特徴付けるNHEJアッセイの具体例を 図4に示します。この例では、shControl細胞およびshWASH細胞のNHEJ効率を評価するためにNHEJアッセイを実施しました(図4)。明らかに、WASHの喪失はNHEJ効率の低下をもたらし、NHEJアッセイによって決定されたNHEJ効率の促進におけるWASHの役割を確認しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg"> 図1:NHEJ/HRアッセイのワークフローの概要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg"> 図2:フローサイトメトリー解析のためのゲーティング戦略 (A)無傷の細胞に対するFSC-H/SSC-Hのゲーティング。(B)トランスフェクションされていないHEK-293T細胞を、自己蛍光細胞を除外するためのネガティブコントロールとして使用した。(C)EJ5-GFPおよびpCBASceIプラスミドをトランスフェクトしたHEK-293T細胞をGFP陽性細胞のゲーティング設定に使用した。(D)mCherryプラスミドをトランスフェクトしたHEK-293T細胞を、mCherry陽性細胞のゲーティング設定に使用した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg"> 図3:典型的な結果 (A)NHEJの分析を示す代表的なプロット。(B)HRの分析を示す代表的なプロット、(C)計算方法のモデル図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg"> 図4:WASHはNHEJ効率を促進する(A)shControl細胞およびshWASH細胞におけるNHEJ効率の解析を示す代表的なプロット。(B)shControl細胞とshWASH細胞のNHEJ効率を比較した代表的な統計結果。データは平均SD±示されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、HEK-293T細胞におけるNHEJおよびHRの効率を定量化するための染色体外非相同末端結合(NHEJ)アッセイおよび相同組換え(HR)アッセイについて説明しています。

GFPベースのレポーターシステムを用いたHEK-293T細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the most perilous DNA lesions, capable of inducing substantial genetic information loss and cellular demise. In ...

DNA二本鎖切断は、最も危険なDNA損傷です。これに対して、細胞はDNA二本鎖切断修復のための2つの主要なメカニズム、NHEJとHRを採用しています。NHEJとHRの効率性を別々に定量化することは、それらに関連するメカニズムと要因を調査するために重要です。NHEJアッセイとHRアッセイは、NHEJとHRの効率を測定するために使用される確立された方法です。これらの方法は、DSBの誘導のためのエンドヌクレアーゼI-SceIの認識部位を持つ破壊された緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む、細心の注意を払って設計されたプラスミドに依存しています。NHEJアッセイおよびHRアッセイは、染色体統合アプローチまたは染色体外アプローチを使用して実施できます。染色体統合アプローチにより、染色体コンテスト内でのDSB修復の解析が可能になります。しかし、染色体統合アプローチは長期の細胞を必要とし、複数の細胞株を含む比較研究には適していません。このプロトコールでは、破壊されたGFPおよびI-SceIプラスミドのHEK-293T細胞への一過性トランスフェクションとその後のフローサイトメトリー分析を含む染色体外NHEJおよびHRアッセイについて説明します。これらの非統合レポーターアッセイは、当社のラボを含むいくつかのラボでNHEJ効率とHR効率の評価に採用されています。染色体統合アプローチとは対照的に、この染色体外アプローチでは、確立された安定した細胞株を利用することで、NHEJまたはHRの効率を迅速に分析できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、GFPベースの蛍光を示して...

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

我々は、RNAiを用いて細胞から内因性のBRCA1蛋白質を破壊し、コーディングの変更が含まれているBRCA1点変異体でそれを置き換えることにより、DNA損傷の相同組換え修復のためのアッセイに基づいて組織培養でのBRCA1の変異体をテストするための方法を提供する。...

内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別

HOエンドヌクレアーゼの形成の定量と分析でアニーリングシングルストランドによる染色体転座を刺激サッカロマイセスセレビシエ</em

このプロトコルは哺乳類細胞における点突然変異の修復システムを編集 CRISPR/Cas9 ベースの遺伝子のワークフローについて説明します。ここで、ターゲット ・ サイトで塩基形成測定の詳細な後続実験的戦略と遺伝子編集へのコンビナトリアル...

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。...

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

この記事では免疫染色とクロマチン免疫沈降の重要なステップを紹介します。これらのプロトコルは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し、定量化するために一般的に使用されます。...

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

ここでは、CD4プロモーター近傍の二本鎖切断修復に関連する変異を同定するために使用できるsgRNA/CAS9エンドヌクレアーゼおよび次世代シーケンシングプロトコルを紹介します。...

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

このプロトコルは、スプライシングに対する5'-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1...

スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

私たちは、一連の発光ベースの染色体外レポーター基質を使用して、細胞内の二本鎖切断修復経路の習熟度を評価するためのプロトコルを提示します。...

ハイスループットで定量的な発光ベースのレポーターアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復活性の評価

ここでは、固定哺乳類細胞におけるポリ(ADP-リボース)(PAR)濃縮焦点の細胞ベースの可視化、細胞内局在化、定量解析の方法を説明します。このアッセイにより、ジェノトキシン曝露細胞の核におけるDNA損傷によるPARP活性化部位の定量化が可能となり、塩基切除修復や単鎖断裂修復に関連する部位も含まれます。...

蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性PARP1/PARP2活性化の可視化および定量解析

学ぶHEK-293T細胞におけるDNA二重鎖切断修復効率の評価法。GFPベースのエキストラクロモソームNHEJ・HRアッセイにより、流式細胞計測で非相同末端結合と相同組換えを迅速に定量し、修復メカニズムの解析に活用する。

GFPベースのレポーターシステムを用いたHEK-293T細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析

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