Name: 梅毒スピロヘータである 梅毒トレポネーマ・パリダムの体外培養手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ Treponema pallidumの体外培養法。哺乳類細胞との共培養系により、梅毒病原体の大量生産とクローン培養が可能になり、遺伝子操作や抗生物質スクリーニングの基盤となる。

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<meta charset="utf8"></head><body>哺乳類細胞共培養を用いたT . pallidum のスケーラブルなIn vitro培養

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<li>Hanff, P. A., Norris, S. J., Lovett, M. A., Miller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Treponema+pallidum%2C+Nichols+strain%2C+by+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Dis%22%5BJournal%5D)">Purification of Treponema pallidum, Nichols strain, by Percoll density gradient centrifugation.</a> Sex Transm Dis. 11, 275-286 (1984).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA、pH 8.0</td>シ<td>グマ&nbsp;</td><td>E8008</td><td></td></tr><tr><td>10x アール'Mg2+、Ca2+</td><td>Gibco</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>15 mL および 50 mL 円錐形滅菌使い捨て遠心分離チューブなし&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 極低温バイアル&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>T. pallidum培養用6ウェル細胞培養プレート&nbsp;</td><td>ファルコン</td><td>353046</td><td>プレートには蒸発の少ない蓋が必要です。</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 組織培養フラスコ ベントキャップ付き</td><td>Corning</td><td>43061U</td><td></td></tr><tr><td>93.5% 窒素、5% CO2、1.5% 酸素 前平衡化培地および培養</td>用 <td>N/A</td><td>N/</td>A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>95% 窒素 および 5% CO2</td></tr><tr><td>96ウェル低蒸発透明、平底組織培養処理マイクロプレート</td><td>Corning Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>容量200 ulの調整可能なマルチチャンネルピペット&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A オプションですが、クローニングに非常に役立ちます</td></tr><tr><td>細胞培養グレードの水</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 1066 L-グルタミンまたはフェノールレッドなし</td><td>US Biological</td><td>C5900-03A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 トライガスおよび組織培養インキュベーター用&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>極低温液体窒素細胞培養貯蔵タンク</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てフィルターユニット、0.2 & マイクロ;m , > 100 mL 容量</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルピペット: 25 mL, 10 mL, 5 mL, 吸引</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td></td></tr><tr><td>DMSO(無菌細胞培養グレード)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、熱不活化&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>この製品を強くお勧めします。異なるブランドまたはカタログ番号を使用する場合は、T. pallidum文化の互換性を事前にスクリーニングする必要があります。</td></tr><tr><td>-70°Cを維持する能力を持つ冷凍庫。C または -80 &deg;C</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A T. pallidum; 液体窒素貯蔵は、代わりに使用することができます</td></tr><tr><td>凍結媒体 (Sf1Ep 培地 + 10% [v/v] DMSO)</td><td>N/A</td><td>N/</td>A <td></td></tr><tr><td>適切なフィッティングを備えたガスボンベ</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GasPak 150 ベント式嫌気性ジャー (Brewer Jar)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-816</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トーマの裁定によるヘルバーカウンティングチャンバー</td><td>ホークスリー医療および実験装置</td><td></td><td>T. pallidum</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>&nbsp;Sf1Ep細胞定量用</td></tr><tr><td>インキュベータータンクスイッチ</td><td>NuAire&nbsp;</td><td>NU-1550 TankGuard 自動CO2インキュベータータンクスイッチ</td><td>オプションですが、適切なO2条件を維持するのに非常に役立ちます。</td></tr><tr><td>位相差光学系付き倒立顕微鏡</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sf1Ep細胞培養物の観察用</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>暗視野コンデンサー付き顕微鏡</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>顕微鏡には、40倍の対物レンズと15倍の接眼レンズが必要です。</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>アスピレーター用マルチチャンネルアダプター&nbsp;</td><td>インテグラ</td><td>155520</td><td>オプションですが、</td></tr><tr><td>NaHCO3 (7.5%)</td> <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>トライガスインキュベーター用窒素</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>レサズリン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>Sf1Ep (NBL-11) 細胞</td><td>アメリカンタイプ カルチャーコレクション</td><td>CCL-68</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>ナトリウムSigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 PBS (塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>滅菌試薬リザーバー、50 または 100 mL サイズ</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T. pallidum サンプル、冷凍または新鮮&nbsp;</td><td></td><td></td><td>ウサギ感染またはin vitro培養から</td></tr><tr><td>組織培養インキュベーターは37°Cに維持されています。C、5% CO2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トライガス組織培養インキュベーター 34°C;C、5%CO2、1.5%O2</td><td>Thermofisher</td><td>Heracell&trade;VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator</td><td>オプション、代わりに嫌気性ジャーを使用できます(参照17参照)</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>真空源(家庭用真空など)、真空チューブ、真空計、コネクタ</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>水、細胞培養に適した、フィルター滅菌済み、精製済み</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td>培地調製に推奨、培養のばらつきを低減</td></tr></tbody></table>

梅毒スピロヘータである 梅毒トレポネーマ・パリダムの体外培養手順

Procedures for In Vitro Cultivation of Treponema pallidum, the Syphilis Spirochete

記載された条件を使用すると、 T. pallidum は通常&gt;90%の運動性を保持し、固定相に入る前に約7日間、33時間から45時間の倍加時間で対数的に乗算します(図3)。1週間の間に、スピロヘータは約4〜5倍になります(図4)。).さらに、 T. pallidum の異なる株は、異なる速度で成長する可能性があります。 T. pallidum のSS14グループの株は、Nicholsグループ17の株よりも倍加時間が遅い傾向があります。
培養物の供給は培養時間を数日延長する可能性がありますが、Sf1Ep細胞層は培養の1週間後に失敗することがよくあります。さらに、トレポネームは生物の上限である約5 x 107 / mLに達します。7日間隔で移された培養物は、通常、ラグフェーズがほとんどまたはまったくなく、対数乗算を続けます。静止期の生物は、しばしば通過が困難になります。
ほとんどのT. pallidumはSf1Ep細胞に付着しています。しかし、上清には十分な量の淡蒼菌が残っているため、培地のサンプルを定期的に取り出して生存率と増殖を確認できます。慎重な定量が必要な場合は、除去した培地の量を測定し、T. pallidumの数を定量し、除去した生物の総数を収穫時の最終カウントに追加する必要があります。
以前の研究では、クローニング効率(接種した生物当たりの陽性培養数)は、ウェル当たり2個の T. pallidum を接種した場合で12.5%、1ウェルあたり0.5 個のT. pallidum を接種した場合で6.7%であった27。したがって、任意の正の井戸は、これらの接種のいずれかにおける単一の生物の増殖を表している可能性があります。ただし、結果として得られる集団のクローン性は、親培養で不均一な場所での培養の均一性を調べることによって検証する必要があります。培養物が同質遺伝子であることを実証する最も決定的な方法は、全ゲノムシーケンシング27を行うことである。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig01.jpg"> 図1: T. pallidumin vitro 培養手順のフローチャート。 この図は、Edmondson and Norris (2021)19の許可を得て転載しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig02.jpg"> 図2: T. pallidum 培養試薬を低酸素環境に平衡化するためのシステムの図。 Brewerジャーベントは、Tジョイントを介して真空源(ハウスバキュームなど)およびカスタムガス混合物(5%CO2、バランス窒素および1.5%O2、5%CO2、バランス窒素)を含むガスボンベに接続されます。インライン真空計は、瓶に引き込まれた真空を測定します。真空は瓶内で約-58kPaまで引き込まれます。その後、排気されたジャーにガス混合物がゆっくりと再充填されます。ブリューワージャーは、5%のCO2を3回補充し、最終排気前に窒素のバランスを取り、95%N2、5%CO2、1.5%O2で補充します。その後、培養物または培地を瓶から取り出し、すぐに低酸素インキュベーターに移します。あるいは、Brewerジャーと最初のTジョイントの間のチューブをしっかりと固定し、チューブをTジョイントから切り離し、Brewerジャー全体を34°Cのインキュベーターに移すこともできます。この図は、Edmondson and Norris (2021)19の許可を得て転載しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig03.jpg"> 図3:Sf1Ep細胞とTpCM-2培地で培養した T. pallidum の成長曲線。 パラレルトリプリケート培養物に T.pallidumを播種しました。反復は各時点で収穫されました。結果は、これらのカルチャの平均 + SEM を表します。(A)培養ごとの T.pallidum の変化と(B)パーセントの運動性が示されています。この図は、Edmondson et al.18の許可を得て改作したものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig04.jpg"> 図4:T. pallidum, Nichols株のin vitro培養の継代例。パラレルトリプリケート培養物にT. pallidumを播種し、1:20希釈で毎週通過させた。鋸歯状プロットは、培養ごとの T. pallidum の数と、各時点で新しい培養に移された数を示しています。結果は、3つの生物学的複製の平均±SEMを表しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:培養容器の中量と播種率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2: T. pallidum栽培用 培地。 すべての培地は、調製後にフィルター滅菌する必要があります。Sf1Ep培地は、4°Cで最大2ヶ月間保存できます。TpCM-2は通常、使用の1日前に作られます。解離媒体は分注して凍結する必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

For over a century, Treponema pallidum subsp. pallidum, the spiral-shaped bacterium that causes syphilis, could only be propagated by inoculation and ...

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梅毒スピロヘータである梅毒トレポネーマ・パリダムの体外培養手順

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