ガスクロマトグラフィー/質量分析法によるオオムギのメタボローム解析

オオムギのメタボローム解析の方法を紹介します。この分析法では、代謝物の分画と誘導体化、およびガスクロマトグラフィー/質量分析(GC/MS)による分析を行います。メタボローム解析を使用して、間作と干ばつストレスが穀物に及ぼす影響を判断できます。

この研究の目標は、干ばつが農業に及ぼす影響に対処することです。気候が変化し続けるにつれて、干ばつが増加し、干ばつは食料安全保障に影響を及ぼします。メタボロミクスは、干ばつが私たちの食品に与える影響を特定し、定量化するために重要です。

メタボロミクスにおける大きな課題は、同定された化合物の確実性を高いレベルで達成することです。酸化ステップでヒドロキシルアミンの代わりにメトキシアミンを使用することで、メトキシ基がMSTFAと反応しないため、後続のシリル化ステップの効率が向上しました。環境ストレスに対する植物の応答を観察する現在の方法は、特定のプロセスまたは組織に焦点を当てています。

この方法は、最終穀物製品の化学信号を検出することにより、より統合的です。将来的には、この手法を用いて、干ばつや間作がオオムギにどのような影響を与えるのかを理解したいと考えています。大麦は食料安全保障にとって重要な穀物であり、気候変動がそれにどのような影響を与えるかを理解したいと考えています。

まず、200ミリグラムの大麦粉を固相抽出(SPE)溶媒リザーバーにロードします。小麦粉を200マイクロリットルのメタノールに20分間浸して浸漬します。メタノールを真空下30分間蒸発させて除去します。

乾燥したら、カラムを真空マニホールドに取り付けます。非極性成分フラクションAをジクロロメタンと共に10ミリリットルのバイアルに抽出し、小麦粉が乾くまで真空マニホールドを運転します。次に、メタノールと脱イオン水の混合物を加えて、極性成分画分Bを10ミリリットルのバイアルに抽出します。

小麦粉が乾くまで真空マニホールドを動かします。フラクションAに標準1と標準2を加え、ピペッティングを繰り返して混合します。ロータリーエバポレーターを使用して、減圧下で溶媒を完全に蒸発させます。

次に、サンプルをメチルtert-ブチルエーテル(MTBE)に再溶解してから、メタノールとメトキシドナトリウムをバイアルに加えます。エステル交換を室温で90分間進行させ、磁気攪拌下下で行います。溶液に塩酸水溶液を加えます。

酸性化溶液をジクロロメタンと混合します。長いパスツールピペットでバイアルの内容物を回収し、ピペット内で相を分離させます。塩酸水溶液を添加して有機相を洗浄します。

再度、長いパスツールピペットでバイアルの内容物を収集し、ピペット内で相を分離させます。下部有機相を新しいバイアルに移し、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発して乾燥させます。次に、SPEカラムに無水硫酸ナトリウムを添加します。

蒸発したサンプルをジクロロメタンに溶解し、SPEカラムにロードします。n-ヘキサンとMTBEの3つの部分を含む溶出画分1を10ミリリットルのバイアルに入れます。フラクション1を含む溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させて乾燥させます。

サンプルをn-ヘキサンに再溶解し、GC/MS用のオートサンプラーバイアルに移します。次に、SPEカラムからプレフラクション2を溶出し、その後に続くn-ヘキサンとMTBEの3つの部分を10ミリリットルのバイアルに入れます。プレフラクション2を乾燥するまで蒸発させた後、無水ピリジンに再溶解し、MSTFAを添加する。

結束バンドを使用して、プランジャーを取り外した状態でシリンジの端にニトログローブを固定します。バルーンに無水アルゴンを入れ、使い捨ての針を注射器に取り付けます。バルーンシリンジを無水試薬が入ったボトルの中隔に押し込み、長い針で2本目のシリンジを挿入して溶媒を引き上げます。

サンプルバイアルを無水アルゴンの穏やかな流れで洗い流します。バイアルをパラフィルムで密封した後、摂氏70度のオイルバスに15分間置きます。シリル化後、フラクション2を室温で5分間冷却し、オートサンプラーバイアルにロードします。

標準試料3と4をフラクションBに加え、ピペッティングを繰り返して混合します。2ミリリットルと4ミリリットルのフラクションB混合物を新しいバイアルに移し、それぞれフラクション3とフラクション4に加工します。プレフラクション3をロータリーエバポレーターで蒸発させて乾燥させた後、無水ピリジンと共蒸発させます。

プレフラクション3を無水ピリジンに再溶解し、トリメチルシリイミダゾールを添加します。.サンプルバイアルを無水アルゴンの穏やかな流れで洗い流します。サンプルバイアルをパラフィルムで密封した後、摂氏70度のオイルバスで20分間加熱します。

溶液を室温まで冷却した後、n-ヘキサンと脱イオン水を加えます。混合物を攪拌し、長いパスツールピペットを使用して上部有機相をオートサンプラーバイアルに移します。プレフラクション4をロータリーエバポレーターで蒸発させて乾燥させた後、無水ピリジンで共蒸発させます。

サンプルを無水ピリジンに再溶解し、塩酸メトキシルアミンを加えます。バイアルを無水アルゴンで洗い流した後、パラフィルム密封されたバイアルをシュウ酸塩で70°Cのオイルバスで30分間加熱します。バイアルを室温まで冷却したら、MSTFAを加え、オイルバスで20分間シリレートします。

次に、n-ヘキサンと脱イオン水をバイアルに加え、長いパスツールピペットを使用して下部水相を回収します。最後の洗浄後、ロータリーエバポレーターを使用して水相を蒸発させて乾燥させ、続いて残りの材料を無水アセトニトリルで共蒸発させます。サンプルを無水アセトニトリルとMSTFAに再溶解します。

バイアルを無水アルゴンで洗い流した後、密封されたバイアルを摂氏70度のオイルバスで60分間加熱します。指定した注入量を使用して、サンプルを GC/MS にロードします。摂氏250度の注入温度で、毎分14ミリリットルのヘリウムの分割流でサンプルを実行します。

フラクション 1 とフラクション 2 の場合、カラム温度を 100 °C から 300 °C まで、毎分 4 °C の速度で上昇させます。摂氏300度に達した後、10分間温度を保持します。フラクション3の場合は、カラムを加熱し、実行全体を通して摂氏300度に保持します。

フラクション 4 では、カラム温度を摂氏 70 度から 142 度まで、毎分 2.5 度で上昇させます。142°Cで10分間保ちます。次に、温度を摂氏142度から摂氏235度まで毎分4度で上げ、10分間保持します。

最後に、カラムを摂氏320度で8分間焼きます。