植物寄生性線虫によるジャガイモ根のin vivoおよびin vitro感染による植物寄生性線虫の感染

このプロトコルは、光学顕微鏡による根構造の組織化学的分析のためのin vivo温室条件下での植物寄生性線虫およびジャガイモin vitroトランスジェニック根によるSolanum tuberosum根の感染について説明しています。

作物の寄生線虫感染症に関する研究は、環境条件の変動性の影響を受け、実験結果やデータの再現性に大きな影響を与える可能性があります。

私たちは、植物寄生線虫を用いたジャガイモトランスジェニック根のin vitro培養を、占有スペースが少なく、入手に時間がかからず、汚染や宿主の遺伝的多様性がない信頼できる代替品として開発しました。

作物の根における線虫感染の時間的進行を追跡することは依然として困難です。鑑別染色技術は、感染部位を特定し、線虫のライフステージを正確に区別するための信頼できる方法を提供します。

温室試験と比較して、ジャガイモの重い根は、季節や気候の変化に関係なく、線虫の発生のすべての段階を提供するための連続的で制御システムをサポートします。

したがって、説明されているプロトコルは、いくつかの有望な将来のアプリケーションを提供します。たとえば、植物寄生線虫がどのように宿主に感染し、操作するかについての洞察を提供する分子および細胞メカニズムの詳細な研究が可能になります。

[ナレーター]まず、にんじんを流水道水で洗い、次に一般的な洗剤溶液で破片を取り除きます。ペーパータオルで乾かしたら、滅菌した金属串をにんじんの上部に内側に約1〜2センチ差し込みます。ノズル付きのウォッシュボトルを使用して、ニンジンを96%エタノールで濡らします。にんじんの下端を滅菌したろ紙で吸い取ります。次に、慎重に炎に通します。滅菌ピーラーで、にんじんを上から下に皮をむき、燃やすことを繰り返します。上部と下部を廃棄した後、中央部を滅菌ペトリ皿に入れます。滅菌刃とピンセットを使用して、厚さ1センチメートルの部分を切ります。切片を滅菌ペトリ皿に移します。プレートを密封した後、ニンジンディスクを滅菌するために、両面で60分間紫外線の下に置いてください。ニンジンディスクを摂氏25度の暗闇で1〜2週間インキュベートします。次に、滅菌刃でニンジンディスクの中央にX字型の切開を入れ、半分の深さだけ切ります。少なくとも50の混合ライフステージを含む50マイクロリットルの根病変線虫懸濁液を切開部にピペットで入れます。シャーレを密封した後、暗所で摂氏25度で最大3か月間インキュベートします。根病変線虫を抽出するには、目に見える壊死を伴うニンジンディスクを、滅菌ガラスボウルに入れられた直径8センチメートルの75マイクロメートルのメッシュふるいに移します。次に、椎間板が覆われるまで抗生物質溶液をふるいに注ぎます。暗所で一晩インキュベートした後、滅菌ピペットを使用して、線虫をボウルの底から滅菌されたガラス染色ブロックに移します。1ミリリットルの抗生物質溶液を染色ブロックにピペットで入れ、線虫を30〜40分間沈降させます。使用済みの抗生物質溶液をピペットで取り出し、洗浄プロセスを4〜5回繰り返します。根病変線虫懸濁液をすぐに使用するか、摂氏11度で保管してください。同じサイズのジャガイモ塊茎を選択し、穴、あざ、または柔らかい部分がある塊茎は廃棄します。5リットルのポットにオートクレーブの土と砂を1対1で混ぜ、22.5グラムの徐放性NPK肥料を混ぜます。次に、土面から9センチメートル下の深さにジャガイモを蒔きます。ポットを50〜70%の湿度の温室に入れます。極端な温度を避けて、土壌水分を最大保水能力の70%に維持するために頻繁に水をやります。ジャガイモの植物が出現したら、各植物の周りに均等に分散された4〜6つの穴を開けて、深さを確認します。30,000 匹の生きた混合ライフステージの根病変線虫を含む 8 ミリリットルの懸濁液を穴にピペットで入れます。次に、穴を土の混合物で覆います。対照鉢や根病変線虫を含む鉢については、接種当日は水やりを控えてください。2ヶ月の栽培後、ジャガイモを根こそぎにし、新芽と根を分離して計量します。根系を注意深く洗います。適切な染色技術を使用して、RLN 攻撃部位の根を調べます。洗浄して滅菌したジャガイモ塊茎を容器に入れます。塊茎を25%市販の漂白剤溶液で覆います。容器を閉じて15分間混ぜます。漂白剤を廃棄したら、塊茎を滅菌した水道水で3回すすいでください。次に、フローフードで塊茎を80%エタノール溶液に15分間浸し、激しく攪拌します。エタノールをピペッティングした後、滅菌した水道水で3回すすいでください。滅菌メスで、塊茎の周辺部分を取り除きます。内側の中央部分を厚さ0.5センチメートルのセグメントに分割します。切片を接種するには、まず1ミリリットルのRhizobium rhizogenes懸濁液と9ミリリットルのSH培地を混合します。滅菌メスの先端を希釈した懸濁液に浸し、ジャガイモのセグメントの表面を5回巻きます。セグメントが乾燥したら、それらを半固体SH培地に置き、プラスミドトランスフェクションを促進するために摂氏25度で暗所で3日間インキュベートします。 3日目の終わりに、感染したセグメントを抗生物質を添加した半固体SH培地を含むプレートに移します。3か月後、滅菌ピンセットを使用して、トランスジェニック根の1グラムのクラスターを集めます。根を新鮮な半固体抗生物質を含まないSH培地でプレートの中心に移します。線虫の卵塊を集めるには、根のこぶを入手します。滅菌超極細ピンセットを使用して、倍率20倍に設定された双眼実体顕微鏡で卵塊を注意深く抽出します。卵塊を5ミリリットルの滅菌水道水を入れた蓋付きのペトリ皿に入れ、48時間孵化させます。次に、フローフードで、1ミリリットルあたり100個の線虫を含むJ2懸濁液5ミリリットルを20マイクロメートルのメッシュふるいにピペットで移します。滅菌水道水で洗浄した後、J2線虫を含むふるいの下半分を20%過酸化水素溶液に浸し、円を描くように15分間混合します。滅菌水道水をふるいを通して線虫の上に分配し、洗浄プロセスを2回繰り返します。最終洗浄時に線虫が境界に集まるようにふるいを傾けます。次に、ふるいの境界から1ミリリットルの滅菌超純水をピペットで取り入れて、線虫を回収します。フローフードで、1グラムのジャガイモトランスジェニック根の塊を100匹の無菌線虫を含むSHプレート上に継代培養します。共培養を倒立顕微鏡で100倍倍に定期的に監視します。卵塊が見えるようになったら、根を新しいSH培地プレートに継代培養します。ニンジンディスクの使用により、3か月以内に線虫の個体数が平均100倍に増加しました。ジャガイモ植物は、根病変線虫の個体数が少ない下で目に見える症状を示さなかった。酸性フクシンで染色した後、根皮質でPratylenchus penetransのいくつかのライフステージが観察され、組織の浸透と関連する壊死病変が感染領域ではっきりと見られたことが示されました。ジャガイモトランスジェニック根の発達は、ジャガイモ塊茎切片のメス誘発創傷に沿って最初の細胞塊の成長を示し、その後トランスジェニック根の出現が続きました。培地中で根の持続的な成長が観察され、根の塊は継続的な成長のために新鮮な培地にうまく移されました。ジャガイモのトランスジェニック根培養物は、植物線虫の共培養を確立するために、Meloidogyne chitwoodiの第2段階の幼体に感染することに成功しました。感染した培養物では、成体の雌と卵塊を含む根のこぶが観察されました。によって形成された胆汁組織 Meloidogyne chitwoodiは、卵塊と卵の形成を含む、線虫の発生と繁殖の明確な段階を識別できるトランスジェニックジャガイモの根の感染後に見られました。