光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Hiku Alge Blink博士の研究室へようこそ。本プロジェクトに資金を提供していただいたカリフォルニア再生医療研究所に感謝いたします。蛍光造影剤を用いて幹細胞を標識することで、移植した幹細胞をin vivoで追跡することが可能になります。

ラベル化された幹細胞をその後光学イメージングすることで、生体内での細胞移動を非侵襲的にモニタリングする縦断的研究が可能になります。このビデオでは、ヒト胚性幹細胞とヒト間葉系幹細胞の両方を蛍光染料でラベルする方法を説明します。こんにちは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校放射線科のコントラスト剤研究グループのソフィー・ボディントンです。

本日は、蛍光造影剤を用いて幹細胞を標識する2つの異なる手法をご紹介します。一つは蛍光染料のDiDを用いた間葉系幹細胞の標識であり、もう一つはEndInvitrogenを用いたヒト胚性幹細胞の標識です。まずは、DiDを用いたヒト間葉系幹細胞の標識法から説明します。

間葉系幹細胞の標識の手順を開始するために、まず細胞をトリプシン処理して計数し、定義された細胞数の懸濁液を調製します。これは標準的な組織培養の手法であるため、ここでは詳細に説明しません。標識する細胞を、無血清培地を用いて1 mLあたり100万個の密度で懸濁させます。

まず、細胞懸濁液1mLあたり5µLのDiDコントラスト剤を加えます。次に、ピペッティングで穏やかに溶液を混合します。細胞をラベル標識溶液とともに、6ウェル低接着ディッシュ内で37°Cで20分間インキュベートします。簡単なインキュベーションが完了したら、細胞溶液を15mL遠心チューブに転移させます。

400 RCFで5分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、ラベル化培地を吸引して除去します。その後、PBSで細胞を洗浄します。

ピペットで細胞を吸い上げ、出しすることで、細胞ペレットを確実に解きほぐします。後者の2つのステップをさらに2回繰り返し、計3回の洗浄ステップを行います。

次に、細胞数を計測し、トリパンブルー染色により細胞生存率を判定します。細胞生存率を確認した後、細胞を光学イメージャーで撮像する準備が整います。ヒト胚性幹細胞の標識手順を開始するために、まずコントラスト剤であるインドシアニングリーンを調製します。

次に、プロタミンとして知られるトランスフェクション剤と混合します。まず、1 mgのインドシアニングリーン粉末を量り取り、100 µLのDMSOに溶解させます。この混合物に10% FCSを含むDMEMを400 µL加え、よく振とうします。これにより、インドシアニングリーンの濃度は2 mg/mLとなります。

次に、造影剤のシャトルとして機能し、細胞内への導入効率を高めるトランスフェクション剤であるプロタミンを添加します。10 mg/mLの硫酸プロタミン5 µLを、ICG 300 µLおよび無血清DMEM 300 µLと混合します。その後、複合体を形成させるため、この新しいトランスフェクション溶液を5分間振とうします。

次に、古い培地を吸引して取り除き、予熱したDMEMを10 milliliters、細胞に加えます。あらかじめ調製したプロタミンICG溶液を細胞に加え、ディッシュを37 °Cのインキュベーターに入れることで、1時間のインキュベーションを開始します。インキュベーション完了後、ディッシュをインキュベーターから取り出し、ラベル化溶液を吸引して取り除き、5 millilitersのPBSでディッシュをすすいで細胞を洗浄します。

その後、細胞を37 °Cで5分間トリプシン処理します。ディッシュを揺らすことで、細胞を懸濁状態にするのに役立ちます。次に、ピペッティングをゆっくりと行い、残っているコロニーを分散させます。

10% FCSを含むDMEMを同量ディッシュに加えて、トリプシンを中和します。次に、細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、400 RCFで5分間遠心分離します。その後、完全培地で細胞を再懸濁します。

次に、細胞を40 µmのセルストレーナーに通すことで、残っている凝集塊や複合物を除去します。凝集のない細胞溶液が得られたら、古い培地を吸引し、あらかじめ温めておいたヒト胚性幹細胞完全培地でペレットを再懸濁します。この時点で、マウスフィーダー細胞をヒト胚性幹細胞から分離させる必要があります。

これは、後で幹細胞のみをイメージングできるようにするためです。このため、細胞溶液をゼラチンコートした10 cmのペトリ皿に移します。皿を37 °Cのインキュベーターに入れ、45分間静置します。

この間、ディッシュを動かさないように注意してください。これでフィーダー細胞はディッシュに接着しますが、幹細胞は接着しません。ペトリ皿から溶液を回収し、これでヒト胚性幹細胞のラベル付き単一細胞溶液が得られました。

ここで細胞数をカウントし、トリパンブルー染色による生存率試験を行います。生存を確認した後、細胞をイメージングする準備が整います。スライドでは、蛍光造影剤で標識し、腹腔内（IP）投与した後のマウスにおける幹細胞のin vivo可視化の例を示しています。

連続的な光学的イメージングスキャンにより、細胞がまず肺に蓄積し、その後、肝臓、四肢の骨髄、および甲状腺へと再分布することが示されました。この蛍光ラベルは、蛍光顕微鏡を用いて組織病理学標本中の移植幹細胞を直接描出するためにも使用できます。以上で、細胞標識を行う際に蛍光造影剤を用いて幹細胞を標識する方法について説明しました。

すべての工程を標準化することが重要です。これは、ラベリング効率と細胞生存率を一定に保ち、異なる実験間での結果を比較できるようにするためです。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。細胞標識がうまくいくことを願っております。