光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Dr.Hiku Alge Blinkの研究室へようこそ。このプロジェクトに資金を提供してくださったカリフォルニア再生医療研究所に感謝いたします。幹細胞を蛍光造影剤で標識すると、移植された幹細胞をin vivoで追跡できます。

その後、標識された幹細胞の光学イメージングにより、in vivoでの細胞の移動を非侵襲的に監視できる縦断的研究が可能になります。このビデオでは、ヒト胚性幹細胞とヒト間葉系幹細胞の両方を蛍光色素で標識する方法を示します。こんにちは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校放射線科の造影剤研究グループのソフィー・ボディントンです。

今日は、蛍光造影剤で幹細胞を標識するための2つの異なる技術を紹介したいと思います。1つは蛍光色素DIDによる間葉系幹細胞の標識用、もう1つはヒト胚性幹細胞をエンディンイングラで標識するためのものです。それでは、まず、ヒト間葉系幹細胞をDIDで標識する技術をご紹介します。

間葉系幹細胞の標識手順を開始するには、アニーゼを試してカウントし、定義された数の細胞を含む懸濁液を取得する必要があります。標準的な組織培養技術ですので、詳しくはお見せしません。標識する細胞を、無血清培養培地で1ミリリットルあたり100万個の細胞の密度で懸濁させたいと考えています。

まず、細胞懸濁液1ミリリットルあたり5マイクロリットルのDID造影剤を添加します。次に、穏やかなピペッティングで溶液を混合し、細胞を標識溶液とインキュベートし、摂氏37度の6ウェル低アタッチメントディッシュで20分間インキュベートします。簡単なインキュベーションが完了したら、細胞溶液を15ミリリットルの遠心チューブに移す必要があります。

400 RCFで5分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さないようにラベリングメディアを吸引します。次に、PBSで細胞を洗浄します。

細胞を上下にピペットで動かし、細胞パレットを分割するようにします。後者の2つのステップ。さらに2回繰り返して、合計3つの洗浄ステップがあります。

次に、細胞をカウントし、トリップテストとブルーテストを実行して、細胞の生存率を判断します。細胞の生存率を決定した後、細胞を光学イメージャーでイメージングする準備が整いました。ヒト胚性幹細胞の標識手順を開始するには、まずインドシアニングリーンとして知られる造影剤を調製する必要があります。

次に、プロタミンと呼ばれるトランスフェクション剤と混合します。まず、1ミリグラムのインドシアニングリーンパウダーを計量し、それを100マイクロリットルのDMSOに溶かします。混合物に10%FCSを含む400マイクロリットルのDMEMを加えてよく振ると、インドシアニングリーンの1ミリリットルあたり2ミリグラムの濃度が得られます。

次に、造影剤のシャトルとして機能するトランスフェクション剤プロタミンを添加し、造影剤がより効率的に細胞に入るようにします。次に、5マイクロリットルの硫酸プロタミンを1ミリグラム/ミリリットルで300マイクロリットルのICGと300マイクロリットルの無血清DMEMと混合します。次に、新しいトランスフェクション溶液を5分間振とうして、複合体が形成されます。

次に、古い培地を吸引し、10ミリリットルのPREWARM DMEMを細胞に加えます。我々は、予め調製したプロタミンICG溶液を細胞に加え、皿を37°Cのインキュベーターに入れることによって1時間のインキュベーションを開始する。インキュベーションが完了したら、インキュベーターから皿を取り出し、標識液を吸引し、5ミリリットルのPBSで皿をすすいで細胞を洗浄します。

次に、細胞を摂氏37度で5分間トライプします。皿を振ると、細胞を浮遊状態に持ち上げるのに役立ちます。次に、残りのコロニーを分割するために、ゆっくりと上下にピペット

プシンを中和するために、10%FCSを含むDMEMを同量ディッシュに加えます。次に、細胞溶液を15ミリリットルのチューブに移し、溶液を400 RCFで5分間遠心分離します。細胞をフルメディアに再懸濁します。

これで、細胞を40マイクロメートルのセルストレーナーに通すことで、残留した塊や複合体を取り除くことができます。クランプフリー細胞溶液が得られたら、古い培地を吸引し、ペレットを事前に線虫化した完全ヒト胚性幹細胞培地に再懸濁します。この時点で、マウスフィーダー細胞をヒト胚性幹細胞から分離する必要があります。

これは、後で幹細胞のみをイメージングするようにするために行われます。このために、細胞溶液をゼラチンでコーティングされた10センチメートルのペトリ皿に移します。皿を37度のインキュベーターに入れ、45分間放置します。

この間、皿を邪魔しないように注意してください。これで、フィーダーがディッシュに付着し、幹細胞は付着しなくなります。この溶液をペトリ皿から移し出すと、ヒト胚性幹細胞の標識された単一細胞溶液ができました。

これで、セルをカウントし、それらに対して青色のトリップテストを実行できます。生存率を確認した後、細胞をイメージングする準備が整いました。このスライドは、幹細胞を蛍光造影剤でタグ付けし、IPインジェクションで投与した後、マウスでin vivoで可視化する方法の例を示しています。

連続光学イメージングスキャンでは、肺に細胞が最初に蓄積し、その後、肝臓、四肢の骨髄、甲状腺に再分布していることが示されました。蛍光標識は、組織病理学標本中の移植幹細胞を蛍光顕微鏡で直接描写するためにも使用できます。細胞標識を行う際に、蛍光造影剤で幹細胞を標識する方法を紹介しました。

すべてのステップを標準化することを忘れないことが重要です。これは、一貫した標識効率と細胞生存率を確保し、さまざまな実験の結果を比較するためです。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そして細胞のラベリングに頑張ってください。