初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

この手順は、卵を殻から分離することから始まります。卵の周りで黄身の袋を切り、膜をむいて時計のグラスの上に置きます。胚の上にリングがはめられます。

ビリン膜がリングの上に持ち上げられます。胚を培養皿に移します。培養皿を培養ボックスに移し、培養器に入れ、胚を培養します。

こんにちは、私はヒューストンのテキサス大学とm大学の環境ゲノム医学センターのTure Brick FinnのDelphineです。今日は、卵の外で頬の胚を培養する手順を紹介します。この手順を研究室で使用して、頬胚のU発達に対する抗てんかん薬の影響を研究しています。

それでは始めましょう。この胚培養プロトコルは、加湿インキュベーターで16時間横向きにインキュベートした卵をハンバーガーとハミルトンにすることから始まります。ステージ4。

まず、鉗子で殻を軽くたたいて卵を開き、殻の周りの殻の破片をすべて取り除きます。シェルの上部を取り外し、ステージHH4で廃棄します。胚の長さは約2ミリメートルで、はっきりとした原始的な縞があり、洋ナシ形の帯に囲まれています。ルシータ。

薄いアルブミンは、底の殻を横に傾けて収集します。次に、鉗子で濃厚なアルブミンを取り除きます。パニックコンプトン生理食塩水が入ったパイレックス皿の内側のプラスチック皿に胚を入れます。

最後に、鉗子で残りのアルブミンを取り除きます。これで、胚をリングの中心に配置する準備が整いました。次のステップは、胚をリングに配置することです。

これを行うには、まず、細いハサミを使用して卵黄の袋を傾けて、胚が上を向くようにします。卵黄の袋を赤道以下のレベルで切ります。鉗子でビリン膜をすばやく剥がします。

メンブレンは、粒状または光沢のない面が上を向くように向きを変えます。メンブレンを時計のガラスの上に置きます。次に、ガラスリングをビリン膜の上に置き、胚を中央に配置します。

最後に、ガラスリングの端の周りでメンブレンを持ち上げます。このアセンブリを生理食塩水皿から取り出します。その後、顕微鏡に移して培養物のセットアップを完了します。

胚培養物は、解剖スコープで観察しながらセットアップされます。細い鉗子を使用して、ビリン膜がガラスリングの上にしっかりと持ち上げられていることを確認します。ガラスリングの内側の端から余分なビリン膜を切り取ります。

ピペットや鉗子でメンブレンを突き刺さないように注意してください。次に、滅菌牧草地ピペットでリングの外縁から生理食塩水を取り除きます。生理食塩水で胚をやさしくすすいでください。

卵黄細胞と緩い膜材料を取り除くには、リングの外縁に200マイクロリットルの生理食塩水を追加します。これにより、培養皿への移行が容易になります。最後に、アセンブリを逆さのFalcon 35ミリメートル培養皿で覆います。

これで、胚を培養する準備が整いました。胚の培養を開始するには、Falcon 35ミリメートル培養皿に2.5リットルの薄いアルブミンを追加します。次に、培養皿の蓋の内側の端に200マイクロリットルの薄いアルブミンを追加します。

これにより、培養室が密閉され、細い鉗子を使用して胚の脱水が防止されます。時計のガラスの端に沿ってガラスリングをスライドさせて胚を露出させ、アセンブリを培養皿に移します。パスツールピペットでリングの内面から残留生理食塩水をすべて取り除きます。

皿に蓋をして、胚を加湿チャンバーに入れます。胚は摂氏38度で最大24時間培養できます。胚を24時間培養した後、パラホルムアルデヒドに固定することができます。

添付のビデオで説明されているin situハイブリダイゼーションなどの他の手順では、培養物をインキュベーターから取り出し、すぐに氷の上に置きます。培養皿に氷冷PBSまたは胚をin-situハイブリダイゼーションのために処理する場合はdesy PBSを入れます。鉗子を使用して、胚をビリン膜から切り離します。

牧草地のピペットの鈍い端を使用して、氷が入った新鮮な培養皿に胚を移します。コールドPBSまたはデジーPBS。鈍い鉗子を使用して胚を固定し、皿からPBSを吸引します。

作りたての氷を冷やして加えます。固定パラホルムアルデヒドは毒性が強いです。したがって、これらの手順は、保護メガネと手袋を着用した化学フードで実行する必要があります。

固定時間と温度は、in situハイブリダイゼーションに使用するアプリケーションによって異なります。クライオセクショニングのために摂氏4度で一晩固定します。摂氏4度で6〜8時間固定し、Mount Immunohisto全体の化学反応を行います。

適当な時間固定した後、室温で1時間固定し、固定液を取り出して化学廃棄物として適切に処理してください。次に、皿に氷冷したPBSまたはデイPBSを入れます。胚を全マウントin situハイブリダイゼーションまたは免疫染色に使用する場合は、針またはマイクロダイセクションナイフで頭部と心臓を穿刺することが望ましいです。

これにより、これらの構造が後のステップでプローブや抗体をトラップするのを防ぐことができます。胚を固定する手順を説明したところで、この培養システムを使用して、胚が原始的なストリーク段階にある培養前にin vitroで細胞移動を追跡する方法を見てみましょう。培養期間の終わりには、胚はHH10、長さ2〜3ミリメートルに発達し、培養皿の中央に見えます。

培養直前に細胞群をカルボザニン、蛍光色素眼で標識し、培養、期間を通じてその動きを追跡することが可能です。この場合、ヘンソンノードの下の細胞はDaiでラベル付けされました。これらの細胞は、体節の進行性、体節性の発達に寄与することが示されています。

卵の外で鶏根を培養する方法を紹介しました。この手順を行うときは、胚と室温との接触を最小限に抑えるために、できるだけ早く作業することを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。