흉곽내 주사: 성체 제브라피시 심장에 복합 전달

1. 흉곽 내 주사를 위한 물고기의 준비

1. 그물로 성체 제브라피시(Danio rerio)를 잡아 마취액에 옮깁니다.
2. 1-2분 후 물고기가 수영을 멈추고 수술의 움직임이 줄어들면 플라스틱 숟가락으로 물고기를 만져 어떤 접촉에도 반응하지 않는지 확인하십시오.
3. 배쪽이 위로 향하게 하여 숟가락으로 생선을 젖은 스펀지의 홈으로 빠르고 조심스럽게 옮깁니다. 물고기의 머리는 오퍼레이터의 지배적인 손에서 멀어져야 합니다.

2. 심낭으로의 미세 주입

1. 실체 현미경으로 물고기의 피부 아래에서 뛰는 심장의 움직임을 주의 깊게 관찰하십시오. 박동하는 심장 위와 복부 연골판(ventral cartilaginous plates)에 의해 정의된 삼각형의 중간에 있는 주입 지점을 육안으로 결정합니다(그림 1D). 모세관 끝을 본체 축을 기준으로 30-45° 각도로 삽입합니다(그림 1E). 미세모세혈관 끝으로 피부를 심낭으로 부드럽게 침투시킵니다(그림 1C). 최적의 진입점은 머리보다 복부에 더 가깝습니다.
   메모: 모세혈관을 신체와 심장에 너무 깊숙이 삽입하면 장기가 손상될 수 있으므로 삽입하지 마십시오. 심장 천자의 경우 바늘은 일반적으로 혈액으로 채워집니다. 이 경우 모세혈관을 제거하고 물고기를 실험에서 제외하십시오.
2. 바늘이 심낭 안에 들어가면 마이크로인젝터 장치의 페달을 눌러 주입을 완료합니다.
   메모: 흉강에 공기를 주입하지 않도록 주의하십시오.
3. 주입 후 흉부에서 모세 혈관을 부드럽게 빼내고 즉시 물고기를 시스템 물이 있는 탱크로 옮겨 회복합니다.
4. 마취에서 완전히 회복될 때까지 물고기를 모니터링하십시오.
5. 원하는 시점에 심장을 채취하여 추가 분석을 위해 준비합니다.
   메모: 물고기가 30초 이내에 operculum의 움직임을 재개하지 않으면 플라스틱 피펫으로 아가미에 물을 짜서 물고기를 다시 살리십시오.

그림 1: 성체 제브라피쉬의 흉곽내(IT) 주사. (A) 필라멘트(6인치, 직경 1.0mm)가 있는 당겨진 미세 주입 모세관의 사진과 사용된 바늘 풀러 프로그램의 값. (B) 10% 페놀 레드를 함유한 2.5μL의 용액으로 채워진 필라멘트(6인치, 직경 1.0mm)가 있는 당겨진 미세 주입 모세관의 사진. 바늘의 당겨진 끝의 길이는 최대 7mm입니다. (C) IT 주입 절차의 개략도. (D) IT 주입 절차의 사진. 이 그림은 Bise et al.에서 수정되었습니다. 패널 C와 D의 숫자는 절차의 동일한 단계에 해당합니다 : (1) 물고기는 가습 된 스폰지에 복부 쪽이 위로 향하게 놓습니다. 천자 부위(삼각형의 빨간 점)는 아가미 근처의 가슴 중앙에 있습니다. (2) 바늘이 심낭으로 침투하는 경우. 빨간색 점은 펑크 부위를 나타냅니다. (3) 주사는 심낭강에서 적색 용액의 확산을 관찰하여 모니터링됩니다. (E) IT 주입 계획. 주사 모세혈관과 신체 축 사이의 각도는 심장 천자를 방지하기 위해 30°에서 45° 사이여야 합니다. (F) 표시된 부피의 IT 주입 후 1시간 후의 물고기 흉부 사진. 흰색 화살표는 내부 출혈을 나타낼 수 있는 붉은 조직을 가리키고 있습니다