Intracecal Tumor Cell Injection: A technique to deliver cancer cancer mouse model(내측성 종양 세포 주입: 정소성 대장암 마우스 모델 확립을 위한 암세포 전달 기술)

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 주입을 위한 세포주 준비

참고: 각 주입에 대해 100,000개의 세포가 있는 20μL의 부피를 사용하십시오. 기저막 매트릭스(BMM)를 사용하여 누출을 방지하고 표준화된 주입을 보장합니다. 재현성 있는 결과를 보장하려면 정기적으로 세포주 인증 분석(예: STR 프로파일링을 통해)을 수행하십시오.

1. 모든 대장암 세포주를 표준 배양 조건(37 °C, 5% CO₂)에서 성장시키고 수술 당일에 준비합니다.
2. 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 세포를 수확하고, 세포를 계수하고(예: 콜터 계수기 또는 혈구계에서), 주입할 동물의 수에 따라 모든 주입에 필요한 양을 계산합니다.
3. 피펫팅 손실과 주입 주사기의 데드 볼륨을 설명하기 위해 필요한 부피의 3-5배를 준비합니다.
4. 원심분리기(1,500g에서 5분)를 하고 PBS로 셀 현탁액을 두 번 세척합니다.
5. BMM의 세포를 5 x 10⁶ cells/mL의 농도로 재현탁시키고 얼음 위에 보관합니다.

2. 직교 마우스 모델

1. 수술을 위한 수혜 동물의 준비
   메모: 6-8주 된 NOD를 사용하십시오. Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, NSG) 마우스를 수혜자로 사용합니다. NSG는 성숙한 B, T, NK 세포가 없고 다른 여러 면역 결함이 없는 가장 면역력이 저하된 마우스 중 하나입니다. 그들은 낮은 세포 수가 주입되더라도 안정적으로 종양을 성장시키며, 멀리 떨어진 전이가 발생하기 쉽습니다. NSG 마우스는 우수한 육종가이며 기존의 SPF(Specific Pathogen-Free) 단위에서 보관할 수 있습니다.
   1. 첫 절개 전에 0.05mg/kg의 부프레노르핀을 피하로 주사합니다.
   2. 전신 마취를 위해 3-3.5 vol%의 세보플루란을 사용하십시오. 발가락 핀치 반사의 상실은 충분한 마취를 나타냅니다.
   3. 각막이 건조되지 않도록 마취된 쥐의 눈을 안과 연고로 덮습니다.
   4. 작은 테이블 위에 누운 자세로 쥐를 제지하십시오.
   5. 전기 면도기로 복부를 면도하고(제모 크림은 대안으로 사용할 수 있음) 클로르헥시딘/요오드의 3배 이상과 알코올 70%로 소독합니다.
   6. 멸균 커튼으로 수술 부위를 덮으십시오.
      메모: 수술 전후 항생제의 사용은 선택 사항이며 기관 지침에 따릅니다.
2. 정중선 개복술과 맹장 노출
   1. 가위(메스를 사용할 수도 있음)를 사용하여 하복부 피부의 작은 정중선 절개(3 - 5mm)를 만듭니다. 집게로 복벽 근육 조직을 잡고 가위로 조심스럽게 절개하여 복강을 엽
   니 다.
   2. 외상성 겸자로 맹장을 식별하고 조심스럽게 외부화합니다. 맹장의 블라인드 끝 주머니를 복부에 놓고 두개골을 가리킵니다.
   3. 일단 외부로 나타난 후에는 항상 따뜻한 식염수 면봉을 사용하여 맹장을 촉촉하게 유지하십시오.
3. 이소성 주사, 복부 폐쇄, 수술 후 회복
   1. intracecal 주사의 경우 30G 캐뉼라가 있는 표준 1mL 주사기를 사용하십시오. 이 주사기를 마이크로 주입 펌프에 장착하면 마이크로 매니퓰레이터에 장착됩니다.
   2. 외상성 겸자로 맹장 끝을 조심스럽게 잡고 따뜻한 식염수로 적신 두 번째 집게로 아래쪽으로 쓰다듬어 부드럽게 펴줍니다.
   3. 캐뉼러를 맹장 바로 위에 놓습니다.
   4. 양안 수술용 현미경으로 육안으로 제어할 수 있는 상태에서 다음 단계를 수행합니다.
   5. 맹장의 외면된 부분의 양쪽 끝에 있는 두 개의 외상성 집게로 맹장을 조심스럽게 잡고 약간 늘린 다음 평행하고 바로 위에 평행하게 위치한 캐뉼라 위로 천천히 당깁니다. 전체 장 벽을 천공하지 않는 것(따라서 세포를 내강에 주입)뿐만 아니라 누출 및 복막 파종으로 이어질 수 있으므로 초기 침투 지점 이상으로 장막을 천공하지 않는 것이 중요합니다.
      1. 캐뉼라를 장 쪽으로 옮기지 말고 장을 캐뉼라 쪽으로 움직입니다. 두 집게 사이에 장을 잡고 스트레칭합니다. 떨림을 줄이기 위해 외과의의 손이 표면에 닿아 있어야 합니다.
   6. 혈청(serosa, 벽내 혈관 위의 매우 얇고 반투명한 내벽으로 보임)과 근육 사이에 세포를 주입합니다. 따라서 캐뉼러는 시각적으로 혈관 위와 얇은 반투명 막 아래에 배치되어야 합니다.
   7. 캐뉼라가 대장 벽 내부에 있는 동안 떨림을 줄이기 위해 풋스위치를 사용하여 주사를 시작하십시오.
   8. 캐뉼라가 제자리에 고정되면 주입을 시작합니다. 20초의 지속 시간을 사용하여 펌프의 제어 장치에서 1μL/s를 설정합니다.
      메모: 손상된 혈관 내부 또는 그 근처에 주사하면 직접적인 혈관 내 전파 및 원격 전이가 발생하므로 피해야 합니다.
   9. 주입이 완료된 후 캐뉼라를 뒤로 당겨 조심스럽게 제거합니다.
   10. 맹장 아래에 마른 면봉을 놓고 증류수로 맹장을 철저히 헹구어 누출된 세포를 용해시켜 인공 복막 전파를 방지합니다.
4. 복부 폐쇄 및 수술 후 회복
   1. 헹군 후 맹장을 부드럽게 복강으로 되돌립니다.
   2. 빠르게 흡수되는 6-0 러닝 봉합사로 복벽을 닫습니다.
   3. 수술 상처 클립으로 피부를 봉합하십시오.
   4. 마취에서 완전히 회복될 때까지 38°C로 설정된 가열 지도에 마우스를 놓습니다.
   5. 다음 48시간 동안 마우스의 수술 후 상태를 면밀히 관찰합니다. 고통스러운 경우 12시간마다 0.05mg/kg 부프레노르핀으로 치료하십시오.
   6. 적어도 하루에 한 번 쥐를 모니터링하여 종양 성장으로 인한 고통의 징후가 있는지 확인합니다.