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Abstract

출처: Merenda, A. et al., CRISPR-concatemer를 사용한 마우스 소장 오가노이드의 다중 유전자 녹아웃에 대한 프로토콜. J. Vis. 특급 (2017).

이 동영상은 CRISPR 연결체를 사용하여 배양된 쥐 장 오가노이드 세포에서 여러 유전자를 동시에 knock-out하는 유전자 knockout 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 병든 유전자를 제거하고, 유전자의 기능과 그 패럴로그를 밝히는 데 사용된다.

Protocol

1. CRISPR-concatemer 벡터를 위한 gRNA 디자인

참고: 이 섹션의 목적은 최상의 타겟팅 전략을 선택하는 방법과 CRISPR-concatemer 벡터에 대한 특정 돌출부를 포함하는 gRNA를 설계하는 방법을 설명하는 것입니다.

1. 선택한 CRISPR gRNA 디자인 도구를 사용하여 관심 유전자에 대한 gRNA를 설계합니다. 예제는 재료 표를 참조하십시오.
   메모: 한 쌍의 paralogous 유전자를 표적으로 할 때, 유전자당 하나의 gRNA를 설계하는 것이 가능하더라도, 이중 knockout을 달성할 가능성을 높이기 위해 유전자당 두 개의 gRNA를 설계하는 것이 좋습니다(그림 1).
2. 제한 매핑 도구를 사용하여 gRNA에 BbsI 인식 부위가 포함되어 있지 않은지 확인합니다(예시는 Table of Materials 참조).
3. 표 1과 같이 각 올리고에 특정 CRISPR-concatemer 벡터 돌출부를 추가합니다.

2. CRISPR-concatemer Vector에 gRNA 클로닝

1. 올리고의 인산화 및 어닐링
   메모: 이 단계는 각 gRNA oligo에 대해 상단 및 하단 가닥을 어닐링하는 방법과 단일 반응에서 말단을 인산화하는 방법을 보여줍니다.
   1. 아래 지침에 따라 올리고를 인산화하고 얼음 위의 상단 및 하단 가닥을 어닐링하기 위한 반응 혼합물을 준비합니다.
      메모: 모든 올리고는 하나의 반응으로 풀링될 수 있습니다. 예를 들어, 4개의 gRNA-concatemer 벡터의 경우 8개의 oligo를 함께 풀링합니다.
   2. 3개의 연결체의 경우, 3.0 μL gRNA 상단 가닥 (각 gRNA에서 1.0 μL; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3.0 μL gRNA 하단 가닥 (각 gRNA에서 1.0 μL; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2.0 μL T4 DNA 리가제 완충액 (10x), 1.0 μL T4 PNK를 사용하고, 총 부피 20.0 μL에 H₂O를 추가합니다.
   3. 피펫팅으로 잘 섞고 다음 설정을 사용하여 열순환기에서 실행합니다: 37°C에서 30분, 95°C에서 5분, 0.3°C/분에서 25°C로 램프다운, 4°C에서 유지.
2. BbsI 셔플 반응
   메모: 이 섹션에서는 pre-annealed gRNA oligos가 digestion과 ligation의 주기를 번갈아 가며 한 단계로 concatemer 벡터의 적절한 위치에 통합됩니다.
   1. 반응 혼합물을 DNase/RNase가 없는 물에 1:100으로 희석하여 3 및 4 gRNA 연결체 벡터를 생성합니다.
      메모: 2개의 gRNA-concatemer를 클로닝할 때는 이 단계가 필요하지 않습니다.
   2. 아래 지침에 따라 얼음 위에서 BbsI 셔플링 반응을 조립합니다. 벡터만 포함하는 음수 제어를 포함합니다.
   3. 100ng CRISPR-concatemer 벡터, 10.0μL 올리고 혼합물, 1.0μL BSA 함유 제한 효소 완충액(10x), 1.0μL DTT(10mM), 1.0μL ATP(10mM), 1.0μL BbsI, 1.0μL T7 리가아제 및 H_2O를 총 부피 20.0μL까지 사용합니다.
   4. 피펫팅으로 잘 혼합하고 다음 설정을 사용하여 thermocycler에서 실행합니다: 3 및 4 gRNA concatemers 클로닝을 위해 50 사이클을 실행하고 2 gRNA concatemer를 위해 25 사이클을 실행하며, 둘 다 37 °C에서 5분 동안, 21 °C에서 5분 동안 유지하고, 37 °C에서 15 분 동안 유지한 다음 4 °C에서 영원히 실행합니다.
3. 엑소뉴클레아제 치료
   메모: 이 단계는 선형화된 DNA의 흔적을 제거하여 복제의 효율성을 높이므로 적극 권장됩니다.
   1. BbsI 셔플링 반응을 DNA 엑소뉴클레아제(Table of Materials) 참조)로 다음과 같이 처리한다.
   2. 이전 단계(2.2.3)에서 11.0 μL 결찰 혼합물을 취하여 1.5 μL 엑소뉴클레아제 완충액(10x), 1.5 μL ATP(10 mM), 1.0 μL DNA 엑소뉴클레아제를 첨가하고 물과 함께 총 부피를 15.0 μL로 올립니다. 37 ° C에서 30 분 동안 배양 한 다음 70 ° C에서 30 분 동안 배양합니다 .
      메모: 이 단계는 혼합물에 남아 있는 선형화된 DNA를 제거하여 클로닝 효율을 높입니다.
   3. 열 충격에 의해 화학적으로 가능한 대장균 박테리아로 변형시키기 위해 반응 혼합물 2μL를 사용하십시오.
      참고: 또는 반응을 -20°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

3. Electroporation에 의한 장 오가노이드의 형질 주입

참고: 이 절차는 2015년 Fujii 등이 발표한 프로토콜을 기반으로 하며, 마우스 소장 오가노이드 배양에 맞게 조정됩니다.

1. 사전 electroporation
   메모: 이 섹션에서는 배양 배지에서 모든 항생제와 컨디셔닝 배지를 제거하여 전기천공법 전에 마우스 장 오가노이드를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 이렇게 하면 전기천공법 중 발생할 수 있는 독성 효과를 방지할 수 있습니다.
   1. transfection 절차의 0일차에 오가노이드를 1:2 비율로 분할합니다.
      참고: 장 오가노이드 배양은 이전에 확립된 프로토콜에 따라 crypt isolation을 수행하여 얻을 수 있습니다. 모든 미디어 구성에 대해서는 표 2를 참조하십시오.
      1. 전기천공을 위해 오가노이드를 분할할 때 transfection당 48웰 플레이트의 최소 6웰을 시딩합니다.
      2. 오가노이드를 20 μL-basement 매트릭스 방울에 파종하고 가습 인큐베이터에서 37 °C, 5 % CO₂ (앞서 설명한 대로)에서 WENR + Nic 배지 (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide)로 성장시킵니다.
   2. 2일차에 WENR+Nic을 항생제 없이 250μL의 EN(EGF + Noggin) + CHIR99021(Glycogen Synthase Kinase-3 억제제) + Y-27632(ROCK 억제제)로 대체하여 배지를 변경합니다(표 2 참조).
      참고: 모든 단계에서 48웰 플레이트의 각 웰에 추가되는 배지의 양은 250μL입니다.
   3. 3일차에 오가노이드 배지를 항생제 없이 EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 변경합니다.
2. 세포의 준비
   메모: 여기에서는 기계적, 화학적 해리를 통해 오가노이드를 작은 세포 클러스터로 단편화하는 방법을 설명합니다. 이러한 단계는 절차의 성공에 매우 중요합니다.
   1. 4일차에 1mL 피펫 팁을 사용하여 지하 매트릭스 돔을 파괴하고 오가노이드를 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 48웰 플레이트의 4웰의 내용물을 튜브에 풀링합니다.
   2. P200 피펫으로 약 200회 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 작은 조각으로 분해합니다. 실온에서 원심분리기, 600 x g에서 5분.
   3. 배지를 제거하고 펠릿을 1mL의 세포 배양 등급 재조합 프로테아제에 재현탁시킵니다(재료 표 참조). 37°C에서 최대 5분 동안 배양한 다음 4x objective.
      를 사용하여 도립광 현미경으로 50μL 샘플 방울을 확인합니다. 메모: 10-15개의 세포로 구성된 클러스터가 바람직한데, 이는 전기천공법 후 세포 생존을 증가시키기 때문입니다.
   4. 세포 현탁액을 결합력이 낮은 15mL 튜브로 옮기고 항생제 없이 9mL의 기저 배지를 첨가하여 해리를 중단합니다(표 2 참조). 실온에서 600 x g에서 5분 동안 원심분리기를 한 다음 상등액을 버리고 펠릿을 1mL의 환원된 혈청 배지에 재현탁합니다(재료 표 참조).
   5. Bürker’s chamber가 있는 세포의 수를 세고 전기천공 반응당 최소 1 x 10⁵개의 세포를 사용합니다. 15mL 튜브에 9mL 환원 혈청 배지를 첨가하고 실온에서 400 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
3. 전기천공법
   메모: 다음 섹션에서는 전기천공법을 수행하는 방법과 나중에 오가노이드를 회복시키는 방법에 대한 지침을 제공합니다.
   1. 모든 상등액을 제거하고 펠릿을 전기천공법 용액에 재현탁합니다(재료 표 참조). 세포 현탁액에 총 10μg DNA를 추가하고 100μL의 최종 부피에 전기천공법을 첨가하고 세포-DNA 혼합물을 얼음 위에 유지합니다. CRISPR-concatamer 벡터를 Cas9 발현 플라스미드(예: Addgene #41815)와 1:1 비율로 사용합니다.
      메모: 첨가된 DNA의 총 부피는 총 반응 부피의 10% 이하여야 합니다.
   2. 형질주입 효율을 평가하기 위해 GFP 플라스미드를 포함하는 별도의 형질주입 혼합물을 포함시킵니다(예: pCMV-GFP, Addgene #11153 또는 제네릭 GFP 발현 플라스미드).
   3. cell-DNA 혼합물을 electroporation 큐벳에 추가하고 electroporator 챔버에 넣습니다. electroporator의 해당 버튼을 눌러 임피던스를 측정하고 0.030-0.055kΩ인지 확인합니다. 표 3.
      에 표시된 설정에 따라 electroporation을 수행합니다. 메모: 임피던스 값이 허용 범위를 벗어나면 큐벳에서 용액 부피를 조정하십시오.
   4. 큐벳에 400μL의 전기천공법 완충액 + Y-27632를 추가한 다음 모두 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세포가 회복될 수 있도록 실온에서 30분 동안 배양한 후 실온에서 400 x g에서 3분 동안 회전시킵니다.
   5. 상층액을 제거하고 펠릿을 20 μL/웰의 지하 매트릭스에 재현탁합니다. 48웰 플레이트에 웰당 약 1 x 104 – 1 x 105 세포를 시딩하고 EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v DMSO 배지를 추가합니다. 37 °C에서 배양합니다.
   6. 5일차에 배지를 EN + CHIR99021 + Y-27632로 변경하고 GFP 발현을 관찰하여 transfection efficiency를 확인합니다(그림 2). 오가노이드를 37°C로 유지하고 2일 후에 EN + CHIR99021 + Y-27632 배지를 새로 고칩니다.
   7. 9일차에 배지를 WENR + Nic + Y-27632로 변경하고 37°C에서 배양합니다.
      메모: Y-27632는 7-10일 후(16-19일) 제거할 수 있습니다.

	카세트 1	카세트 2	카세트 3	카세트 4
시퀀스(5′-3′)	CACCGG[gRNA1]GT	ACCGG[gRNA2]지	CCGG[gRNA3]	아카그그[gRNA4]GTT
시퀀스(5′-3′)	타아악[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-gRNA2]씨	AAAC[RC-gRNA3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

표 1: CRISPR-concatemer 벡터의 각 카세트에 대한 돌출부.

. .

기초 매체		코멘트
4 °C에서 4 주 동안 보관하십시오
세포 배양 배지	500 밀리리터	재료 표 참조
L-글루타민	100x 5 mL
버퍼링 제 1 M	5 밀리리터	재료 표 참조
페니실린 스트렙토마이신	100x 5 mL
WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + 니코틴아미드)
4 °C에서 2 주 동안 보관하십시오
기초 매체	최대 50 mL
신경 세포 무혈청 보충제(50개)	1 mL	재료 표 참조
뉴런 세포 무혈청 보충제(100개)	500 마이크로L	재료 표 참조
n-아세틸시스테인(500mM)	125 마이크로L
마우스 EGF (100 μg/mL)	25 마이크로L
마우스 노긴 (100 μg / mL)	50 마이크로L
R-Spondin 컨디셔닝 배지	5 밀리리터
Wnt3a 컨디셔닝 배지	25 밀리리터
니코틴아미드(1m)	250 마이크로L
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + 노긴 + CHIR + Y-27632)
4 °C에서 2 주 동안 보관하십시오
페니실린 스트렙토마이신이 없는 기초 배지	최대 20mL
신경 세포 무혈청 보충제(50개)	400 μL	재료 표 참조
뉴런 세포 무혈청 보충제(100개)	200 마이크로L	재료 표 참조
n-아세틸시스테인(500mM)	50 마이크로L
마우스 EGF (100 μg/mL)	10 μL
마우스 노긴 (100 μg / mL)	20 마이크로L
Y-27632 (10 μM)	20 마이크로L
CHIR99021(8μM)	10 μL
EN (EGF + 노긴)
4 °C에서 4 주 동안 보관하십시오
기초 매체	최대 50 mL
신경 세포 무혈청 보충제(50개)	1 mL	재료 표 참조
뉴런 세포 무혈청 보충제(100개)	500 마이크로L	재료 표 참조
n-아세틸시스테인(500mM)	125 마이크로L
마우스 EGF (100 μg/mL)	25 마이크로L
마우스 노긴 (100 μg / mL)	50 마이크로L

표 2: 오가노이드 배지 구성.

개 개

	포링 펄스	전달 펄스
전압	175볼트	20볼트
펄스 길이	5밀리초	50밀리초
펄스 간격	50밀리초	50밀리초
펄스의 수	2	5
감쇠율	10%	40%
극성	+	+/-

표 3: Electroporation 조정.

Representative Results

Materials

Optimized CRISPR Design Tool 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA ligase buffer 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA Ligase 	New England Biolabs	 M0318L
DTT (dithiothreitol) 	Promega 	P1171
ATP (adenosine triphosphate) 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI) 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
Plasmid-safe exonuclease 	Cambio 	E3101K
Thermal cycler 	Applied biosystems 	4359659
10G competent E. coli bacteria 	Cambridge Bioscience 	60108-1
Advanced DMEM/F12(cell culture medium)	Invitrogen 	12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M (buffering agent) 	Invitrogen 	15630-056
Penicillin-streptomycin 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x	Invitrogen 	17504-044
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x	Invitrogen 	17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
Mouse EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
Mouse Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
Nicotinamide 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin conditioned medium 	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
Standard BD Matrigel matrix 	BD Biosciences	356231
48-well Plate 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE (recombinant protease)	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM (reduced serum medium)	Life technologies	 51985-034
Electroporation Cuvettes 2 mm gap 	NepaGene 	EC-002S
Low binding 15 mL tubes 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s chamber 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21 Super Electroporator 	NepaGene 	contact supplier
Protein LoBind tubes low binding	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress electroporation buffer 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	 AppliChem	 A3672