생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

난소 종양 세포 I. 준비

1. 문화 루시페라제을 표현하는 난소암 세포 라인을 성장. 루시페라제의 소스 반딧불, Renilla 또는 다른 종의 수 있습니다. 형광 단백질을 표현하는 세포도 사용할 수 있습니다. 이 예제의 경우 우리는 반딧불 루시페라제을 표현하는 난소암 세포 라인, OVCAR5를 사용합니다.
2. 일상적인 세포 배양 기술을 이용하여 수확 세포.
3. 칼륨의 세포 현탁액 (10,000 세포 / μL)는 사출 시간까지 얼음 호수 (PBS)를 버퍼 유지.

II. Intrabursal 사출

이 절차는 두 사람의 도움이 필요합니다. 모든 수술 절차는 무균 조건 하에서 실시하고 있습니다. 이것은 수술 복장을 입고 및 무균 수술기구, 주사기 및 주사 바늘을 사용하여 포함합니다.

1. 케타민을 염산염 (100 MG / ML), xylazine 염산염의 1.6 ML (100 MG / ML), acepromazine (10 MG / ML)의 1.5 ML, 그리고 0.9 %의 나트륨 염화물의 20 ML 3 ML을 혼합하여 마취 솔루션을 준비합니다.
2. 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. 8 선량 볼륨 ~ 9 ML / kg 체중 (BW)와 intraperitoneal (IP) 주입을 통해 준비 케타민을 - xylazine - acepromazine 마취와 동물을 마취.
3. 동물이 동물은 뒷다리 발톱에 포셉 또는 손가락으로 발가락 핀치를 수행하여 마취의 수용 일반 아래에 있는지 확인합니다. 페달 반응이있다면 동물이 프로 시저에 응답하기 전까지, 마취의 깊이 일반 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
4. 머리가 떨어져 직면하고 꼬리가 당신쪽으로 향하게과 멸균 거즈 패드에있는 동물 등의 측면을하다. 절개의 요점은 난소 위의 왼쪽 또는 오른쪽으로 정중선의 및 위치하고 있습니다. 절개 지점에 70 % 알코올로 모피를 면도 또는 젖었어.
5. 포셉를 사용하여 침수 피부를 허용하고 dorsomedial 위치에 직접 난소 지방 패드 위에 가위로 작은 절개를합니다. 난소 지방 패드는 복막 벽의 표면 아래에 표시되어야합니다. 지방 패드 그것을 둘러싼 어두운 분홍색 조직 대조의 흰 색깔로 쉽게 알아볼 수 있습니다.
6. 부드럽게 복막 벽을 라이닝을 리프트하고 위에 설명된대로 작은 절개 (5)합니다.
7. 절개에 인접한 정중선에 멸균 생리 젖었 거즈 패드를 놓습니다. 난소 지방 패드를 찾아 조심스럽게 그것을 꺼내와 거즈로 그것을 휴식. 불독 클립과 지방 패드를 고정하여 난소를 안정화. 해부 현미경, 위치에 따라 난소로 부르사 이어지는 수란관 가느다란 관 벤드으로 바늘의 삽입 (30 게이지, G)를 허용합니다. 바늘이 적절한 위치에 삽입하면, 그것은 부르사에 따라 표시되어야합니다.
8. 부드럽게 주사기가 주사 사이트에 위치하는 동안 부르사과 난소 사이의 세포 현탁액의 5 μL를 주입하는 주사기의 플런저를 밀어. 이 단계는 두 사람을 필요로합니다. 다른 사람이 바늘의 위치를​​ 유지하는 동안 한 사람이 플런저를 못살게 굴지. 찔린 사이트를 밀봉하기 위해 신속하게 바늘을 제거하지만 부르사와 가느다란 관의 분열 부드럽게 충분하지. 부르사 약간 적절한 주사와 함께 커지는 것으로 나타납니다.
9. 불독 클립에서 지방 패드를 출시하고 부드럽게 복막 구멍에 생식 트랙트 지방 패드를 다시 교체하십시오. 하단 안감을 통해 상부 복막 안감을 떼어하여 신체 벽을 부드럽게 닫습니다. 외과 스테이 플스 또는 부상 클립과 함께 피부를 닫습니다.
10. 다시는 케이지에 복구 동물을 장소와 저체온증 방지 및 복구 속도를 안전한 열원을 제공합니다. 호흡 속도와 용이성, 근육 톤의 반환하고, 자발적으로 이동할 수있는 능력을 모니터링합니다. 이러한 회복을 향해 진보의 좋은 지표입니다. 스테이 플스이나 상처 클립은 7 일 이상 게시 수술을 제거할 수 있습니다.

III. 구강 Gavage 관리

1. 둥근 팁과 함께 18 ~ 20 G gavage 바늘이나 수유 튜브를 사용하십시오. gavage 바늘이 동물의 머리 끝부분에서 마지막으로 갈비뼈의 거리보다 더 이상이어야합니다.
2. 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. 엄지와 손가락으로 어깨를 통해 피부를 쥐고하여 부드럽게 아저씨 동물. 억제하는 방법의 각 측면과 밖으로 연장하는 포어 팔다리에 대한 충분 회사되어야합니다. 동물 바늘에서 파악하지 못할 수 있습니다.
3. 부드럽게 목을과 식도를 통해 직선을 형성하여 검지 손가락으로 동물의 머리를 뒤로 당기십시오. 엄지의 안쪽과 동물 등을 지원합니다.
4. 부드럽게하고 강제하지 않고, 입 양쪽에 있고 혀 위에 gavage 바늘을 삽입합니다. 단칼에에서 바늘은 입천장에 대한과 식도 아래로 통과해야합니다. 중력 회의 저항하지 않고 바늘을 안내합니다. 어떤 resistan가있다면CE는 바늘을 제거하고 다시 시작합니다. 동물의 개그와 삼키기 반사는 삽입하는 동안 발생 수 있습니다. 그러나, 저항이나 동물로부터 온다있을 수 없습니다. 동물이 바늘은 콧구멍과 가슴의 움직임을 선택하여 장소에있을 때 호흡 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
5. 천천히 선량 볼륨을 하는걸 주사기의 플런저를 밀어.
6. 부드럽게 그것이 식도를 삽입했던 방법과 동일한 각도와 경로에서 gavage 바늘을 제거합니다.
7. 5 ~ 10 분 정도의 케이지와 모니터의 호흡과 행동으로 동물을 반환합니다.

IV. VIVO 영상에서

우리는 intrabursal 캐비티에 주입 세포의 동작을 모니터링하는 칼리퍼 생명 과학을 사용합니다. 이 시스템을 사용하는 실험은 일반적으로 종양 이식의 시간에서 4 ~ 16 주간의 기간이 있습니다.

1. 1 ML PBS에 5 ~ 20 밀리그램을 분해하고 살균을위한 0.22 μm의 막을 통해 필터링하여 D - luciferin (반딧불 루시페라제의 기판)의 솔루션을 준비합니다.
2. 산소와 isoflurane 가스 모두에 회전에 의해 유도 챔버를 부과합니다. 단지 유도 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 동물이 몇 군데 준비되기 전까지는 isoflurane 유량이 낮은 수준에서 관리하고 있습니다.
3. 동물의 식별 번호와 띄는 건강을 확인합니다. isoflurane 가스 충전 유도 챔버에있는 동물을 놓으십시오.
4. 동물 anesthetized 것으로 나타납니다 때 챔버에서 동물을 제거합니다. 30 G 바늘을 사용하여 IP를 통해 사출 준비 luciferin 솔루션 200 μL를 제공합니다. 연구를 통해 luciferin 분사 및 이미징 성능 사이의 시간 일관성을 유지하기 위해 분사 시간을 기록하는 것이 중요합니다.
5. 유도 챔버에 luciferin - 주입 동물 돌려 놓으십시오.
6. 적절한 설정으로 이미징 시스템을 설정합니다. 최초의 동물 이미지를 인수하기 전에 시스템을 초기화해야합니다.
7. 유도 챔버에 가스 흐름을 끄고 이미징 챔버에 가스 흐름을 켜십시오.
8. anesthetized 동물 지느러미 또는 복부 측면을 놓으십시오. 적절한 마취 유도를 유지하기 위해 코 콘에있는 동물들의 코를 배치해야합니다. 동물과 같이 녹색 조명으로 표시 "이자 그리드의 시점"이내에 있는지 확인하십시오.
9. 챔버의 문을 닫고 적절한 시간에 이미지를 획득. 시간은 동력학에 의해 결정하실 수 있습니다.
10. 이미징 챔버에서 동물을 제거하고 그 케이지에 돌려 놓습니다. "Intrabursal 사출"에 설명된대로 동물들의 복구를 모니터링합니다.

V. 대표 결과

그림 1. orthotopic 마우스 모델에서 난소 종양 세포의 생체내 이미징에서. 루시페라제 표현 OVCAR5 세포는 바로 난소에 intrabursally 주입하고 시간이 지남에 따라 몇 군데 있었다. 이미지는 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 주사 후 13 일 (왼쪽), 17 일 (중간) 및 22 (오른쪽) 찍은. 도설 측면은 상단 패널에 표시하고 복부 쪽이 낮은 패널에서입니다. 참고 사출 다음과 같은 종양 세포의 복막 확산 22 일.

동물 실험 폭스 체이스 암 센터의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.