JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

Abstract

출처: Tirumalai, V., et al. 식물 MicroRNA의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석. J. Vis. Exp. (2020)

이 비디오에서는 식물 조직에서 추출한 전체 RNA에서 microRNA(miRNA)를 검출하고 정량화하는 하이브리드화 기술인 노던 블롯을 시연합니다.

Protocol

1. 젤 전기 이동법

1. 사전 실행을 중지하고 샘플 로딩 전에 웰을 세척합니다.
2. 샘플을 98°C에서 1분 동안 가열하고 모세관 팁을 사용하여 샘플을 웰에 뜨겁게 로드합니다. sample이 웰에서 하나의 얇은 층을 차지하도록 웰 바닥에 팁을 삽입합니다.
3. 모든 샘플의 로딩을 완료합니다. RNA 10년 마커 로딩을 포함합니다.
4. 브로모페놀 블루 염료가 거의 완전히 실행될 때까지 80V에서 젤을 실행합니다. 브로모페놀 블루는 15% 변성 아크릴아마이드 겔에서 10bp로 작용합니다.

2. 전기 블로팅 준비

1. N+nylon 멤브레인을 유리판 치수로 자르고 오른쪽 상단 모서리에 있는 멤브레인에 HB 연필로 라벨을 붙입니다.
2. 멤브레인을 멸균수 표면에 부드럽게 놓고 라벨이 부착된 면이 물 표면을 향하도록 합니다. 멤브레인을 15분 동안 미리 담가둡니다.
3. 압지 I 4장을 섬유 패드 크기로 자릅니다.
4. 카세트의 회색 면을 깨끗한 트레이에 넣어 젤 샌드위치를 준비합니다.
5. 파이버 패드를 미리 적셔 카세트 위에 놓습니다. 기포를 제거하십시오.
6. 압지 한 장을 1x TBE에 미리 적셔 섬유 패드 위에 놓습니다. 종이 위에 플라스틱 피펫을 굴려 기포를 제거합니다. 미리 젖은 압지 한 장을 더 깔고 기포를 제거합니다.
7. 실행 중인 카세트에서 겔을 조심스럽게 제거하고 첫 번째 로드된 RNA 샘플이 오른쪽을 향하도록 샌드위치 설정 위에 놓습니다.
8. 미리 담근 멤브레인을 1x TBE에 부드럽게 담그고 라벨이 있는 면이 아래를 향하도록 하여 겔 위에 놓습니다. 롤아웃하여 기포를 제거합니다.
9. 압지 한 장을 담그고 멤브레인 위에 놓고 기포를 제거합니다. 압지 한 장을 더 찍어 샌드위치 셋업 위에 놓고 기포를 제거합니다.
10. 미리 젖은 광섬유 패드를 설정 위에 놓고 카세트를 단단히 닫아 샌드위치를 완성합니다.
11. 트랜스블롯 카세트를 모듈에 놓고 TBE 1개, pH 8.2를 블로팅 마크까지 채웁니다.
12. 10V에서 전송하고 밤새 4°C에서 전송합니다.
13. 이식 후 축축한 멤브레인을 종이 시트에 놓고 254nm 자외선(120,000μjoules/cm²)을 조사하여 RNA를 멤브레인에 즉시 가교 결합합니다. 가교 결합 블롯은 추가 혼성화를 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 방사선 표지 프로브 준비

1. 검출할 작은 RNA를 완전히 보완하는 프로브를 설계합니다.
2. 표 32에 제공된 레시피에 따라 구성 요소를 결합하여 5′ 끝 부분에 ƳP1ATP(BRIT에서 획득)를 사용하여 프로브에 레이블을 지정합니다.
3. 위의 반응 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
4. 제조업체의 프로토콜에 따라 Sephadex G-25 컬럼을 사용하여 라벨링되지 않은 ƳP32ATP를 프로브에서 분리합니다.

4.블롯의 혼성화

1. RNA 면이 상단을 향하도록 교차 연결된 블롯을 혼성화 병 안에 넣습니다.
2. 초고감도 혼성화 완충액을 격렬하게 혼합하고 10mL를 첨가한 다음 35°C로 유지되는 혼성화 오븐 내에서 회전을 통해 블롯을 배양합니다.
3. 20분 동안 사전 하이브리드화를 수행합니다.
4. 오븐에서 병을 꺼내고 라벨이 붙은 프로브를 혼성화 버퍼에 부드럽게 추가합니다.
5. 35°C에서 12시간 동안 회전하면서 블롯을 혼성화합니다.
6. 혼성화 후 혼성화 용액을 15mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 이 용액은 재사용할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
7. 2x SSC 버퍼와 0.5% SDS를 추가하여 과도한 혼성화 용액을 제거하기 위해 2분 동안 블롯을 빠르게 세척합니다. 용액을 버리십시오.
8. 2x SSC 버퍼와 0.5% SDS로 35°C 동안 블롯을 30분 동안 회전시키며 배양합니다.
9. 35°C에 대해 0.5x SSC 버퍼와 0.5% SDS로 블롯을 다시 세척하고 30분 동안 회전합니다.
10. 블롯을 혼성화 커버 내부에 놓고 여분의 버퍼를 제거한 다음 밀봉합니다.
11. 카세트 내부의 방사선이 없는 형광체 이미저 화면에 밤새 노출시킵니다.
12. 생체 분자 이미저를 사용하여 혼성화 신호를 감지하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.

표 1: 레시피 표

. . 표시기 표시기 표시기

버퍼 및 용액	처방	코멘트
10 X TBE	0.89M 트리스 버퍼	pH는 아세트산을 사용하여 8.2로 설정해야 합니다
0.89M 붕산
30mM 에다
젤 믹스	15% 아크릴아미드-비스아크릴아미드 졸, 19:1	젤 혼합물에는 요소 결정이 포함되어서는 안 됩니다.
	8M 요소
	1X 티베
젤 로딩 염료	0.05 %(W/V) 브로모페놀 블루	탈이온화된 포름아미드를 취급하는 동안 주의해야 합니다
	0.05 %(w/v) 크실렌 크시아놀
	100% 탈이온화 포름아미드
프로브 라벨링	PNK 버퍼(10X, 2μL)	이 혼합물에는 방사성 분자가 포함되어 있으며, 이 단계는 방사성 실험실 내부의 숙련된 직원이 수행해야 합니다.
	PNK 효소 (1 μL)
	올리고(100μM, 0.1μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
세척 버퍼 – I	2X SSC
	0.5%(w/v) SDS
워시 버퍼 – II	0.5X 증권 시세
	0.5%(w/v) SDS
스트리핑 버퍼 – I	0.5X 증권 시세
	0.1%(w/v) SDS
스트리핑 버퍼 – II	0.1X 증권 시세
	0.1%(w/v) SDS

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution 	Sigma 	A9926	Chemical
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700	Chemical
Blotting paper	Whatman blotting paper I	1001-125	Assay
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G	Chemical
Capillary loading tips	BioRad	2239915	Plastic ware
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Chemical
Heating block 	Eppendorf	5350	Device
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B	Assay
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA	Plastic ware
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79	Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	Chemical
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194	Device
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75	Device
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M	Plastic ware
Plastic pipette	Falcon	357550	Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU	Device
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501	Device
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130	Device
Spinwin	Tarsons	1010	Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S	Assay
Transblot apparatus	BioRad	1703946	Device
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670	Assay
Urea	Fischer Scientific	15985	Chemical
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	Device
Vortex	Tarsons	3020	Device
Water bath	NEOLAB	D-8810	Device
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G	Assay