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Abstract

출처: Hahnewald, S., et al Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays. J . Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 내이에서 나선신경절 외식부위를 분리하고 다전극 어레이에서 코르티 기관과 함께 배양하는 과정을 보여줍니다. 나선신경절(spiral ganglia)은 조심스럽게 추출되어 더 작은 조직 절편 또는 외식부로 절편화됩니다. 이러한 외식은 다전극 어레이의 활성 영역에서 배양되어 신경 세포 프로세스 성장을 촉진합니다.

Protocol

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 실험을 위한 솔루션 준비

1. 세포외 기질(ECM) 코팅 용액 준비(재료 표 참조): 얼음에서 ECM 혼합물을 해동합니다. ECM 혼합물을 염기성 배양 배지(신경 영양 인자 또는 소 태아 혈청(FBS) 없음)에 1:10으로 희석하고 얼음에 보관합니다.
2. 배양 배지 준비(재료 표 참조): FBS 또는 BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor)를 포함하지 않는 Neurobasal 배지 스톡을 준비합니다. 세포 배양에 추가하기 직전에 새로운 FBS(10%) 및 BDNF(5ng/ml)로 neurobasal 배지를 보충합니다.
3. 세포외 용액을 준비합니다(재료 표 참조).

2. MEA의 세척 및 살균

참고: 실험에 사용된 MEA에는 직사각형 그리드로 배열된 68개의 전극이 포함되어 있습니다(그림 1E). 각 전극의 크기는 40 x 40 μm²이며 중심에서 중심까지의 간격은 200 μm입니다. 전극은 백금으로 만들어집니다. 전극은 인듐 주석 산화물로 만들어진 회로에 의해 해당 접점에 연결됩니다. 이 회로는 5μm의 SU-8 층으로 절연되어 있습니다. 공급자에 대한 자세한 내용은 재료 테이블을 참조하십시오. 다른 MEA 레이아웃이 이러한 실험에 적합할 수 있습니다.

1. 새로운 MEA의 경우: 70% 에탄올에 30초 동안 담가 헹구고 증류수로 30초 동안 세척합니다. 층류 후드에서 작업합니다.
2. 층류 후드에서 MEA를 30분 동안 건조시킵니다.
3. 각 MEA를 개별 멸균 페트리 접시(35mm x 10mm)에 넣고 호일로 밀봉합니다. MEA는 사용할 때까지 보관할 수 있습니다.
4. 사용한 MEA의 경우: RT에서 오비탈 셰이커에서 1ml의 효소 용액(재료 표 참조) O/N이 포함된 페트리 접시(35mm x 10mm)에서 MEA를 배양하여 생물학적 물질을 제거합니다. 그런 다음 2.1.
   단계에서와 같이 계속합니다. 메모: 끝이 고무로 덮인 집게를 사용하여 MEA를 주의해서 다루십시오.

3. 배양 실험을 위한 MEA 준비

1. 밀봉 호일을 제거하고 전체 실험을 위해 MEA를 페트리 접시(35mm x 10mm)에 그대로 둡니다.
2. 1.1에서 준비된 용액으로 MEA를 코팅: 차가운 200μl 피펫 팁(-20°C에서 보관)을 사용하여 전체 전극 영역을 덮는 각 MEA에 50μl의 코팅 용액을 피펫으로 코팅합니다.
3. RT에서 30분에서 1시간 동안 MEA가 코팅되도록 합니다.
4. 피펫을 사용하여 코팅 용액을 제거합니다. 10% FBS 및 5ng/ml BDNF가 보충된 100μl의 배양 배지를 적용하고 조직을 도금할 때까지 RT 상태로 둡니다.
5. 코팅된 MEA가 들어 있는 페트리 접시 2개를 큰 페트리 접시(94mm x 16mm)에 넣고 가습을 위해 1.5ml의 PBS(Phosphate Buffered Saline)가 들어 있는 세 번째 작은 페트리 접시를 추가합니다.
   메모: PBS를 함유한 작은 페트리 접시(3.5단계)를 추가하는 것은 배양 배지의 증발을 크게 최소화하는 데 중요합니다.

4. 나선형 신경절 해부

참고: 전체 해부는 층류 후드 외부에서 수행할 수 있습니다(단계 4.1에서 4.4). 미세 해부의 경우 멸균 상태(층류 후드)가 필수입니다(단계 4.5부터).

1. 동물(5-7일 된 생쥐)을 사전 마취 없이 참수하여 안락사시킵니다.
2. 70% 에탄올을 분사하여 머리를 살균합니다.
3. 머리를 잡고 시상선을 따라 날카롭거나 날카로운 가위로 피부와 두개골 사이의 연결을 끊습니다.
4. 두개골을 궁지처럼 자르고 날카롭거나 뭉툭한 가위를 사용하여 뇌를 제거합니다.
5. 두개골에서 측두골을 잘라내고 멸균된 얼음처럼 차가운 행크스 균형 소금 용액(HBSS)이 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.
6. 해부 현미경을 사용하여 미세한 집게를 사용하여 고막을 해부하고 내이를 분리합니다.
7. 가는 집게를 사용하여 달팽이관의 뼈를 제거합니다.
8. 나선신경절(SG)의 기저 부분과 SV를 겸자로 잡고 SV를 기저부에서 정점까지 천천히 풀어 나선형 인대와 선조혈관(SV)을 함께 제거합니다
.
9. 코르티(Corti, OC), SG 및 모디올러스(modiolus)의 기관을 분리합니다(그림 1A-C).
10. 집게로 SG와 OC의 기저 부분을 잡고 OC를 기저부에서 정점까지 천천히 풀어서 OC를 SG 및 modiolus에서 분리합니다.
11. 모디졸루스(그림 1D)에 아직 붙어 있는 나선신경절(spiral ganglion)에서 겸자와 마이크로 메스를 사용하여 측방외식(직경 200-500μm)을 자릅니다.

5. MEA에 대한 나선형 신경절 이식 문화

1. 100 μl의 배양 배지로 미리 준비된 MEA의 전극 옆에 두 개의 나선형 신경절 외식재를 놓습니다.
2. Corti의 기관을 전극 영역에서 약 5mm 떨어진 곳에 놓습니다.
3. 겸자를 사용하여 외식부위와 코르티 기관을 MEA에 고정하면서 조직 손상을 방지합니다.
4. MEA를 37°C 및 5% CO₂에서 인큐베이터와 배양에 조심스럽게 놓습니다. 다음 날, 외식이 MEA에 부착되었는지 육안으로 검사합니다.
   메모: 외식식물이 O/N을 부착하지 않은 경우 앞으로 며칠 동안 거의 부착하지 않습니다. OC는 영양/신경 영양 지원을 위해 배양에 인접하게 배치됩니다.
5. 10% FBS 및 BDNF를 함유한 배양 배지 100μl를 연속 5일 동안 매일 첨가합니다.
6. 6일차에 10% FBS와 5ng/ml BDNF를 함유한 배양 배지 2ml를 추가하고 추가로 13일 동안 조직을 배양합니다.

Representative Results

Materials

Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049	24 ml (for 25 ml)
HEPES	Invitrogen	15630-080	250 μl (for 25 ml)
Glutamax	Invitrogen	35050-061	250 μl (for 25 ml)
B27	Invitrogen	17504-044	500 μl (for 25 ml)
FBS	GIBCO	10099-141	10% (for 25 ml)
BDNF	R&D Systems	248-BD-025/CF	Final 5 ng/ml (for 25 ml)
NaCl			145mM
KCl			4mM
MgCl2			1mM
CaCl2			2mM
HEPES			5mM
Na-pyruvate			2mM
Glucose			5mM
PBS	Invitrogen	10010023
BSA	Sigma	A4503-50G	2%
Triton X-100	Sigma	X100	0.01%
Petri dish 35 mm	Huberlab	7.627 102
Petri dish 94 mm	Huberlab	7.633 180
Dumont #5 tweezer	WPI	14098
Dumont #55 tweezer	WPI	14099
Enzymatic solution: Terg-a-Zyme	Sigma	Z273287-11KG
Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM	Corning	356230
MEA electrodes	Qwane Biosciences		(Lausanne, Switzerland)