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Summary

RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.

Abstract

RNA 중합 효소 II (폴 II)의 transcriptional 활동은 역동적인 과정이므로 생체내의 transcriptional 프로세스의 속도론을 측정하는 것은 중요하다. 폴 II의 속도론이 생화 학적 또는 분자 방법을 사용하여 측정하고 있습니다. ^1-3 최근에는 새로운 시각화 방법의 개발, 그것은 하나의 살아있는 세포에서 실시간으로 발생하는 등 전사에 따라 가능한되었다 ^4. 여기에 우리는 방법에 대해 설명합니다 특정 유전자 로커스 (DNA), 그 mRNA의 제품 및 최종 단백질 제품이 찬란 표시 및 생체내에서 시각 수있는 세포주를 사용하여 살아있는 세포의 특정 유전자에 대한 폴 II 신장 속도론의 분석을 수행할 수 있습니다. ^{5, 6} , 그것은 관심의 유전자에 mRNAs의 실제 전사를 감지할 수 있습니다. ^{7, 8} mRNA가 찬란 mRNA의 기록의 3'UTR 24 MS2 줄기 루프를 포함하는 생체내에 태그 mRNAs위한 MS2 시스템을 이용하여 태그입니다 그것이 베꼈는데 그대로 mRNA를 레이블 YFP – MS2 코트 단백질에 대한 매우 구체적인 구속력이 사이트를 제공하는 반복은 ^9. 우리가 (FRAP) 메서드를 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하여 녹음의 속도론을 모니터링합니다. 녹음의 사이트에있는 YFP – MS2 – 태그 초기 기록을 photobleaching 후 시간이 지남에 따라이 신호의 복구를 수행함으로써, 우리가 새로 만든 mRNAs의 합성 속도를 얻는 ^5. 즉, YFP – MS2 형광 복구 생성을 반영 새로운 MS2의 형광 무료 YFP – MS2는 주변 nucleoplasm에서 입력 분자에 의해 초기 기록과 바인딩에 줄기 루프. FRAP 복구 곡선은 다음 녹음의 운동 시간 매개 변수를 검색하기 위해, 미분 방정식의 시리즈 공식 수학 기계론의 모델을 사용하여 분석하고 있습니다.

Protocol

사용 전지 시스템은 태그 살아있는 세포에서 mRNA를위한 MS2 반복 시퀀스를 포함하는 통합 유전자 구조를 포함해야합니다. 5 '유전자의가 락 연산자가 포함되어 있습니다 (이 프로토콜에서 우리는 찬란 (그림 1A) 다음과 같이 DNA, RNA 및 단백질 수준 ⁸ 분류되는 안정 통합 β – 굴지의 유전자를 품고 인간 U2OS 세포 라인을 사용하여 lacO) 반복 – 이러한 유전자를 (DNA)에 태그를 사용함으로써 통합의 게놈 로커스를 확인하고 있습니다. 찬란 태그 락 억제 단백질 (LacI)는 lacO 반복에 바인딩과 DNA에 태그를합니다. mRNAs은 MS2 반복 (줄기 루프)에 바인딩 YFP – MS2 단백질로 추가됩니다. 유전자 제품은 CFP – 굴지이며, 따라서 유전자의 유도는 CFP – 태그 굴지의 cytoskeleton의 모양으로 발생합니다. 유전자 구조는 U2OS Tet – 온 안정 세포주에 transfected과 표현 Tet transcriptional 통제입니다.

1. 세포 도금 및 transfection :

1. 48시간 전에 측정, 씨앗 ~ 2 * 10 유리 바닥 조직 문화 요리 ⁵ 셀 (14mm 유리 바닥 microwell (0.16-0.19 mm의 두께 35mm 배양 접시,. 캣 번호 P35G – 1.5-14 – C , MatTek, 애쉬 랜드, MA)). 50~80%의 합류에 도달하기 위해서는, 세포 매체 2ml를 추가합니다.
2. 24시간 실험 전에 transiently 태그 DNA와 mRNA에 대한 형광 마커를 표현하는 구성으로 세포를 transfect. FuGENE6 transfection 시약 (로체)를 사용하십시오.
   사용되는 구성 :
   1. YFP – MS2 – NLS는 mRNA의 기록에 MS2 줄기 루프에 태그를합니다. 핵 지방화 시퀀스 (NLS)가 YFP – MS2 단백질에 대한 핵 항목 순서를 제공합니다.
   2. 옵션 – 5 '유전자의에서 lacO 반복을 바인딩되며 유전자 로커스 레이블을 것입니다 CFP – LacI 또는 RFP – LacI. 태그를 유전자 로커스는 FRAP 실험 동안 유전자를 추적 지원하지만, 필요하지 않습니다.
3. 일시적 transfected 단백질 (주 참조)을 잘 표현을 얻으려면, 적어도 12 시간을위한 세포를 품어.
4. 실험 Tet – inducible CFP – 굴지의 유전자의 활성화를위한 세포를 1.5 μg / ML doxycycline (시그마)를 추가 12시간 전에 – 6.

참고 :
* 그래서 배경 신호에 비해 전사 사이트에서 구체적으로 얻은 신호를 마스크하지 transfected 단백질의 매우 높은 표현 수준에 도달하지 않는 것이 중요합니다. 에 핵 수출 신호 (NES)를 추가 C), B) promotor의 강도 (예 : CMV는 L30 모터보다 강력한입니다) 변경) transfection과 실험 사이의 시간을 조정 : 표현의 레벨로 제어할 수 전체 셀에 YFP 신호를 배포하는 데 도움이됩니다 YFP – MS2 – NLS 단백질.

* 측정에 사용 형광단이 선호 길이 인수를 통해 photostable되어야하므로 녹색 / 노란색 발광 fluorophores 붉은 fluorophores보다됩니다. 다른 fluorophores에 관한 정보는 심판이 ^10에서 찾을 수 있습니다.

* 다른 빛을 채널 출혈을 통한하지 않는 것이 서로 확인합니다. 별도 마커의 각 레이블 표본을 포함한 사용 슬라이드는 각 슬라이드에 두 채널의 강도를 측정하고, 다음 출혈을 통해 계산합니다.

2. FRAP :

실험은 이미지를 획득하고 레이저 빔을 photobleaching 실적을 모두 할 수있는 모든 현미경을 수행할 수 있습니다. 일반적으로, FRAP 실험은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)로 수행됩니다. 그러나, 우리의 경우에는 이후 실험 (15-30 분) 비교적 긴이며, 우리가 핵 내에 작은 로커스를 따르고 있습니다, 그것은 모든 실험을하는 동안 초점에있는 유전자 로커스 / 전송 사이트를 계속 할 수 있어야 중요합니다. 이것은 시간 (4D)을 통해 3 차원의 빠른 영상을 필요로하고, 같은 인수 가격은 스캐닝 공촛점 현미경을 사용하여 얻을 수 어렵습니다. 따라서, 우리는 빠른 속도로 이미지를 수집할 수 있습니다 EM – CCD (퀀트 – EM, 로퍼)을 갖춘 넓은 분야 올림푸스 IX81 현미경 (63X 계획 – APO, 1.4 NA)에 내장된 3D – FRAP 시스템 (Photometrics)를 사용 (최대 30 이미지 / 초). 시스템은 샘플의 관심이 특정 지역 (ROI)에 photobleaching 수 있도록 카메라와 동기화할 수있는 405 나노미터와 491 nm의 레이저가 있습니다. 현미경은 람다 DG – 4 광원 (셔터) 및 Z – 축에 신속하고 정확한 이미지를 허용 XY & Z 스테이지 (이전)를 갖추고 있습니다. 모든 장비는 통합 MetaMorph (분자 장치)에 의해 제어됩니다. 라이브 셀 실험은 살아있는 세포 챔버 시스템 (도카이)를 사용하여 ₂ ° C 5 % CO와 37 수행됩니다.

1. 절차 : 30 분 실험 전에 가열 장치, 현미경과 레이저를 켜십시오. experi 동안온도가 일정하게 유지 필요 ment가, 그렇지 않으면 그것은 긴 획득 시간 동안 초점의 변화가 발생할 수 있습니다. 레이저 전원이 일관 전원 출력을 안정해야합니다.
2. 카메라와 함께 레이저를 동기화 :
   1. 세포를 (DIC를 사용)를 포함하지 않는 접시에서 지역을 검색합니다.
   2. 실험에 사용되는 동일한 조명 채널을 사용합니다. 여기서 우리는 YFP 채널에 대해 491 nm의 레이저를 사용합니다.
   3. 이미지의 중간에 레이저를 가리 킵니다.
   4. 동기화 버튼을 클릭하십시오 (매크로를 제공)를 사용합니다.
   5. 레이저와 카메라가 동기화되는 것을 보장하기 위해 현장에서 다른 장소를보십시오.
3. 실험을 위해 좋은 후보 세포를 선택합니다. 우리가 안정적인 세포 라인에서 작동하지만, 우리는 모든 세포와 유사한 표현 수준을 가지고 것을 발견했습니다. 있는만큼 이후 완전히 복구할 수와 b)는 충분한 여유 YFP – MS2 세포에 단백질을 가지고, A) 확실한 YFP – MS2 – 태그 확산 YFP – MS2 배경 위에 전사 사이트를 전시 : 좋은 후보자는 세포 것입니다 (-; 왼쪽 셀에 표백을위한 좋은 후보 아니 두 세포를 비교 그림 1B에 예) photobleaching.
4. 적절한 측정 조건을 선택합니다. FRAP 절차는 여러 이미지의 습득을 필요로하고, 따라서 합리적인 노출 시간과 가능한 한 낮은 조명으로 사용 간의 균형을하는 것이 중요합니다. 높은 가벼운 수준 phototoxicity로 인해 세포에 영향을 줄 수 있으며 photobleaching하게됩니다. 그것은 다른 실험 사이 영상 매개 변수가 상수 유지하는 것이 좋습니다.
   전지는 150 밀리초 노출 시간과 YFP 채널에서 몇 군데, 그리고 CFP – lacI (게놈 로커스)의 검출에 대한 CFP 채널 인치 아르 YFP – MS2 mRNA 신호 (옵션) photobleached 경우에도 CFP – LacI 태그 로커스를 따라하면 유전자의 검출이 가능합니다. 각 인수에 대한, 7 Z – 350 nm의 모든 조각을 촬영하고 있습니다. 활성화된 전사 사이트는 491 nm의 레이저를 사용하여 표백 있습니다.
5. 전체 실험을 수행하지만, 표백하지 않고. FRAP 실험은 정상 상태로 돌아갑니다 전사 사이트에 걸리는 시간을 측정합니다. 첫째, 우리는 활성 전사 사이트가 안정된 상태에서 기능하고 안정되어 있는지 확인합니다 싶어요. 따라서, 우리는 전사 사이트의 측정 농도는 실험 기간 동안 변경되지 않도록하기 위해 표백하지 않고 완벽한 FRAP 실험을 수행하지만. 우리는 또한 전체 이미지 시리즈로 인한 총 photobleaching을 측정하여 이미징 조건을 테스트하기 위해이 실험을 사용합니다. 엄지의 규칙으로, 전체 영화 photobleach는 초기 강도의 30 % 이상해서는 안됩니다. 이것은 첫번째 이미지 (비율이 0.7보다 큰되어야 함)으로 나눈 마지막 이미지에서 핵에 동일한 장소의 강도 비율을 사용하여 측정할 수 있습니다.
6. FRAP : 활성 전사 사이트에서 YFP – MS2 신호가 491 nm의 레이저를 사용하여 표백 있습니다. 6 미리 표백 이미지가 취득됩니다. 포스트 표백 이미지 3 시간 주파수의 순서 찾았 : 15 이미지를 매 3 초, 15 영상 매 6 초, 26에게 (또는 긴 실험 45) 이미지를 매 30 초. 인수 이미지 주파수의 변화는 신호의 변화가 적게 두드러진 때 끝 부분 가장 높은 강도의 변화 (초기 복구), 그리고 적은 이미지를 보여주 시대 더 많은 이미지를 얻기위한 수 있습니다.

주 :이 실험을한다는 점에서 '일반'FRAP과 다릅니다
전형적인 FRAP 실험은 세포의 다른 단백질의 이동성을 측정하는 반면 전사 사이트에서 mRNA의 * FRAP은 초기 mRNA에 YFP – MS2 단백질의 바인딩을 측정합니다. 따라서, YFP – MS2 단백질의 잘 퍼지는 수영장을 측정에는 관심이 없습니다. 표백 및 첫 번째 인수 이미지 사이의 시간이 비교적 긴 경우는 무료 YFP – MS2 단백질이 diffusing 수영장을 무시하는 것이 가능합니다.

YFP – MS2 신호의 회복 (15-30 분) 상대적으로 길이 * 때문에 그것은 초점에서 전사 사이트를 유지하는 것이 중요합니다. 그 Z – 조각 일련의이 모든 시점에서 취득하는 이유입니다.

3. FRAP 데이터의 정상화 :

4D FRAP 데이터가 무료 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ를 (; NIH, 베데스다, MD 사용하는 분석이다 http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). 다음은 ImageJ 소프트웨어를 통해 사용할 수 매크로와 분석을 수행하지만, 물론 자기 작성된 매크로가 생성하실 수 있습니다.

1. Z – 스택 최대 자세한 분석을 위해 시간이 지남에 따라 2D 영화에 발생하는 모든 시간이 지점에서 예상하고 있습니다.
2. 전사 사이트는 각 프레임에 추적되고 의미 강도는 스팟 트래커 도구를 사용하여 측정됩니다. ¹¹ 데이터가 추가 분석을위한 엑셀 시트에 저장됩니다.
3. 때마다 포인트에 대한 관심 (ROI)의 다른 지역에서 평균 농도는 (ImageJ의 플러그인의 시간 시리즈 분석기를 사용하여) 다음과 같이 측정 :) 다시지상은 셀 = B (T) 이외의 투자 수익 (ROI)에서 가져옵니다. nucleoplasm의 B) 투자 수익 (ROI)하지만까지 가능한 표백제 사이트에서 = C (T). C) 전사 사이트 = S (T) (로 현장 추적기로 측정).
4. 이미징 동안 발생 photobleaching에 대한 데이터를 수정 : 다른 모든 측정에서 배경을 제거하고 표백제를 해결하십시오. SC (t)는 시간 t와에서 전사 사이트의 수정된 강도입니다

EQ. 1 :

5. 데이터를 정상화 : 먼저 정상 상태 (= <Sc _{(pre-bleach)>)에서} 전사 사이트의 강도를 보여주는 사전 표백제 이미지의 평균을 계산합니다.

그런 다음 데이터를 정상화 :

EQ. 2

데이터는 적어도 10 실험을위한 표준입니다. 실험의 평균 때마다 점 (그림 1C)에서 오류 막대에 대한 표준 편차 (STD)를 계산합니다.

참고 :
FRAP 분석 중에 YFP – MS2 단백질의 확산은 바운드 YFP – MS2는 mRNA에 높은 친화력과 관련되는 동안 매우 빠른 속도입니다 무료 nucleoplasmic YFP – MS2의 확산 속도 때문에 무시되었고, 전사에 다시 연결하지 않습니다 사이트입니다. 이것은 표백 후 첫 이미지를 분석하기 전에 제거되어야하는 이유입니다.

4. 수학적 모델을 사용하여 데이터를 분석 :

이런 종류의 데이터 집합에서 운동 매개 변수를 검색하기 위해, 우리는 이러한 종류의 데이터에 맞게 수있는 간단한 설명 모델을 사용합니다. 특정 모델의 자세한 설명이 여기에 ⁵ 읽을 수 있습니다. 모델은 그림 2A의 구조를 설명하는 다음과 같은 방정식을 포함 :

모델 매개 변수를 가지고, 그것은 신장 속도를 계산 할 수 있습니다 :

우리는 버클리 마돈나 (사용 곡선 분석 http://www.berkeleymadonna.com를 )로 이전 ⁵ 모델이지만 다른 옵션은 (MatLab, 가상 세포, COPASI 등) 사용할 수 있습니다. 데이터 모델에 맞게되었고 속도 상수가 추출되었다. 우리는 버클리 마돈나의 코드를 첨부합니다. 가장 우리가 안정된 상태를 계산하고 표준 모델에 표준 실험 데이터에 맞게 데이터에 맞게 순서를 유지해야합니다.

5. 대표 결과 :

우리는 높은 레이저 전원을 사용하여 활성 전사 사이트에 표시 mRNA 신호를 photobleached하고, 시간이 지남에 따라 YFP – MS2 신호의 복구를 따랐다. 전사 사이트에서 형광 신호는 mRNA 합성뿐만 아니라 사이트에서 발표 mRNA의 안정 상태의 속도론로 구성되어 있습니다. 표백하지 않고 시간이 지남에 따라 전사 사이트 강도를 측정하면이 유전자가 상대적으로 안정된 상태에서 현재는 것을 의미하는 '상수'신호를 (그림 1C, 붉은 점) 제공합니다. 이것은 새로 베꼈는데 mRNA에 축적되어 신호가 mRNA가 전사 사이트에서 출시되면 단풍 신호와 같다는 것을 의미합니다. photobleached 경우,이 시스템은 정상 상태에서 계속하지만 복구할 수있는 신호 걸리는 시간을 측정하는 현재이 가능합니다. 따라서, 형광의 복구 주로 효소의 신장 특성에 따라 달라집니다. 3D FRAP 시스템 FRAP 복구하는 동안 전체 3D 핵 볼륨의 인수를 허용함으로써 신호는 실험 중에 손실되지 않았습니다. 데이터에서 운동 매개 변수를 계산 들어, 표준 곡선은 미분 방정식을 기반으로하는 운동 모델을 설명하는 신장에 장착되어되었습니다. 간단한 ODE 모델을 사용하여 ⁵ 장점은 그것이 매개 변수에만 소수에 맞게 수있다는 것입니다 . 모델의 초기 단계 (진입점)은 즉 신장, 새로운 MS2 바인딩 사이트를 합성을 담당하는 프로세스입니다. 최종 단계 (종료 시점)는 nucleoplasm에 mRNA의 릴리스입니다. 모델은 복구 2 번 kinetically 해결의 구성 요소로 구성되어 곡선, 한 빠른 한 느린 기반으로합니다. 느린 구성 요소가 신장하는 동안 일시 중지 효소와 같은 모델로했다 반면 빠른 구성 요소, 연신율을 말합니다. 두 효소의 상태는 일시 중지하는 확률적 전환과 신장으로 모델링되었습니다. 우리는 느린 합성 속도 (2.5 분 누적 시간에 일시 중지)에 확률적 전환과 함께 3.3 KB / 분의 신장 속도를 나왔고이 모델에서 미분 방정식을 최적화. 모델링 THA 보여t 신장에서 일시 중지가 신장을 입력한 polymerases의 단 11 %에 영향이 전환.

K 아웃	0.0112
K pause_in	0.0015
K pause_out	0.0067
신장 시간	(K 아웃 + K pause_out) -1	56 초
일시 중지 시간	(K pause_out) -1	2.5 분
일시 정지 확률	(K pause_in) / (K + K pause_in는 아웃)	11%

표 1. 모델은 매개 변수 테이블에 결과를.

그림 1. (A) 실험 전지 시스템은 생체내의 유전자 발현에 따라 사용됩니다. CFP – 굴지 유전자의 개략도 표현 건설. 5' – 끝이 RFP – LacI (적색)에 의해 바운드 및 유전자 통합 사이트를 표시 아르 256 lacO 반복 일련의 포함되어 있습니다. 최소한의 CMV 프로 모터에서 Transcriptional 유도는 독스의 존재에 Tet – 반응 요소 (트레즈)에 반대 테트라 사이클린 transcriptional 활성제 (rtTA 또는 Tet – 온)의 결합에 의해 이루어진다. 베꼈는데 mRNA는 코딩 CFP – β – 굴지에 대한 순서 및 YFP – MS2 융합 단백질에 의해 구속 있으며 24 MS2 반복이 포함되어 있습니다. 3' – 끝에서, 토끼 β – globin 엑손 – 인트론 – 엑손 모듈의 일부가 절단 – polyA 신호옵니다. 체계는 또한 RNA 폴 II에 의해 베꼈는데 새로 베꼈는데 mRNAs에 부착된 형광 MS2 단백질 (노란색)을 보여주는 연신율 분석을 설명합니다. (B) 활성 전사 사이트 (YFP – MS2, 오른쪽 셀)이 photobleached되었으며 형광 복구 추적 시간이 지남에 (하단에 프레임). 우리는 표백 (중간 라인) 및 비 표백 (결론) 활성 전사 사이트 모두의 형광 강도를 측정했습니다. 왼쪽 셀에 photobleaching 실험에 적합하지 않습니다. (C) 실험 측정 CFP – 굴지의 유전자 전사 사이트에서 수행. YFP – MS2 FRAP 측정 블루 복구 곡선에. 빨강, 안정된 상태에서 전사 사이트의 YFP – MS2 신호를 보여주는 동일한 실험에서 비 표백 세포에서.

그림 2. 전사 사이트에서 YFP – MS2 분자로 표시된 mRNAs의 입구와 출구 속도론을 설명하는 모델 (A) 제도. (B) YFP – MS2의 FRAP 데이터 및 장착 시뮬레이션 (10 실험의 평균이 모델에 장착했습니다) . 적합의 계산된 residuals은 하단에 제공됩니다.

Discussion

살아있는 세포에서 효소 운동 활동을 측정하는 방법은 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 첫 번째 부분은 두 번째 부분에서 데이터가 ODE 모델을 사용하여 분석 반면, 측정 및 mRNA의 전사의 운동 데이터를 가져올 수있는 '서부 유럽 표준시'절차를 설명합니다. ⁵ 연구의 숫자가 지금은 추출이 접근 방법을 활용해야 살아있는 세포 ^{5, 6, 8, 12-14에서} 전사 속도론. 이러한 연구 사이의 주요 차이점은 FRAP 복구 곡선이 운동 매개 변수로 변환하는 방법되었습니다. 많은 경우에 수학적 모델이 사용됩니다. 모델은 간단한 방식으로 생물 학적 과정을 설명해야하고 그 다음 FRAP 데이터에 비교됩니다. 일단 데이터와 모델 사이의 좋은 상관 관계가있다, 하나는 약물 효과를하거나 다른 유전자 사이의 비교 측정과 같은 추가적인 생물 학적 실험의 모델을 확인합니다.

추가 운동 결과를 얻기 위해 더 이상의 분석을하는 것이 가능합니다. 예를 들어, MS2 형광 단백질의 photoactivatable 양식을 사용하여 이미 생성된 mRNA 성적 증명서를 photoactivate 및 전송 사이트에서 그들의 석방을 (강도 대에 = 감소 FRAP에 의해 측정된 신호의 복구)에 따라 수 있습니다. ⁵ 또한, 동안 FRAP MS2 태그 mRNAs 대책의 연신율 속도론만이, 전송 사이트에서 GFP – RNA 폴 II의 FRAP는 전체 transcriptional 프로세스의 운동 즉, 사전 개시, 개시, 연신율 및 종료 ^{5, 13, 15, 16} 산출.

Materials

Doxycycline	Sigma-Aldrich
FuGENE 6 transfection reagent	Roche Group