In vitro photoacoustic flow cytometry: 나노 입자 함유 순환 난소암 세포를 검출하기 위한 비침습적 유동 광음향 기술

흐름 시스템 아키텍처

1. 플로우 챔버 구조

1. 제공된 Solid Works 파일을 사용하여 ABS 열가소성 수지 또는 PLA 플라스틱을 사용하여 흐름 탱크를 3D 프린팅합니다. SolidWorks를 사용할 수 없는 경우 치수가 아래에 제공됩니다. 그림 1A는 이 모델을 나타냅니다. 유량 탱크의 몸체는 2.5cm x 1.5cm x 7.5cm입니다. 플로우 탱크의 맨 끝에는 모세관 튜브가 들어있는 튜브의 진입을 허용하기 위해 직경 약 5mm의 구멍이 있습니다 .
   메모: 유량 탱크에는 초음파 변환기를 배치하기 위해 모세관 방향에 수직인 1cm 구멍이 있습니다. 구멍과 동일한 내경을 가진 원통형 압출은 탱크 내부로 6mm 확장됩니다. 실시간 이미징을 위해 플로우 탱크에는 모세관 바로 아래에 1mm x 3mm 슬롯이 있습니다.
2. 3D 흐름 탱크를 인쇄한 후 사용할 시스템을 청소하고 조립합니다.
3. 흐름 시스템의 1mm x 3mm 슬롯과 1cm 구멍 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다.
4. 누출을 방지하기 위해 실리콘으로 조심스럽게 밀봉하십시오.
5. 모세관을 실리콘 경화 튜브에 끼웁니다. 유리 모세관 튜브가 3mm 슬롯과 1cm 구멍 바로 위와 앞에 오도록 흐름 탱크 측면을 통해 튜브를 흐름 챔버에 삽입합니다.
6. 누출을 방지하기 위해 실리콘을 사용하여 튜브를 밀봉하십시오.

2. 광음향 흐름 시스템 설정

참고: 그림 1B 및 그림 1C는 흐름 시스템 아키텍처의 예를 보여줍니다.

1. 변환기를 초음파 펄서/수신기에 연결합니다. 59dB 게인으로 신호를 증폭합니다.
2. 필터의 출력을 현장 프로그래밍 가능 게이트 어레이가 내장된 다목적 재구성 가능한 오실로스코프에 연결합니다.
3. 플로우 챔버에서 나오는 튜브 중 하나를 각 분기에 있는 두 개의 주사기 펌프에 연결된 T-접합에 연결합니다.
4. 주사기 펌프 중 하나에 공기를 채우고 다른 펌프에 분석할 시료를 채웁니다. 공기가 포함된 펌프를 40μL/min의 유속으로 설정하고 샘플이 있는 펌프를 20μL/min의 유속으로 설정합니다. 그 결과 2상 흐름으로 1μL의 샘플 부피가 생성됩니다. 이 유속에서 시스템은 분당 약 6.4개의 샘플을 테스트합니다.
   메모: 세포의 일관된 분포를 유지하려면 테스트 직전에 각 샘플을 가볍게 와류로 가열합니다. 또한 세포가 용액에 침전되는 것을 방지하기 위해 몇 분마다 주사기를 회전시킵니다.
5. 플로우 시스템에서 나오는 나머지 튜브를 10% 표백제가 함유된 용기에 연결하여 플로우 시스템에서 나온 세포를 폐기합니다.
   메모: 유량 시스템을 사용하기 전에 누출이 유량에 영향을 줄 수 있으므로 누출이 있는지 확인하십시오. 세포는 시술 중 생물학적 안전성을 유지하기 위해 폐쇄된 시스템 내에 포함되어야 합니다.
6. 3D 프린팅 탱크의 설계는 최소한의 보정으로 변환기와 레이저 광 간의 일관되고 반복 가능한 정렬을 가능하게 합니다. 맞춤형 탱크 내에 올바르게 배치되면 석영 모세관 튜브는 변환기와 레이저가 직접 정렬되도록 합니다.
7. 석영 모세관 섹션을 현미경의 시야에서 변환기와 직접 정렬되도록 배치하여 튜브의 전체 너비를 비추도록 샘플 위에 광섬유를 조심스럽게 배치할 수 있습니다.
8. 1,053 nm의 파장에서 작동하는 다이오드 펌핑 고체 레이저를 채널링하는 광섬유를 사용하여 샘플을 조사합니다. 샘플에 입사하는 레이저 광과 광음향 효과를 측정하는 데 사용되는 변환기는 모두 초점이 맞지 않습니다.
9. 샘플에 입사하는 레이저의 에너지는 약 8mJ이며 10Hz 레이저 속도는 시스템을 통과할 때 각 샘플을 여러 번 비추기에 충분합니다.
10. 도립 현미경 위에 유량 시스템을 놓고 샘플이 플로우 시스템을 통과할 때 레이저 펄스와 샘플의 경로가 모두 보이는지 확인합니다. 현미경에 장착된 카메라를 사용하여 흐름을 기록합니다.
11. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 초음파 획득을 기록합니다. FPGA를 사용하여 초음파 및 펄스 레이저를 트리거합니다. PBS 2% Tween에서 100μg/mL 농도의 2% Tween과 함께 PBS를 사용하는 PBS를 각각 음성 및 양성 대조군으로 활용합니다.
12. 현미경에 장착된 카메라를 사용하여 레이저의 발사와 흐름 시스템을 통한 샘플의 통과를 모두 기록합니다. 이러한 녹음은 변환기에 의해 기록된 음향 신호와 레이저 발사를 연관시키는 데 사용됩니다. 샘플이 레이저 발사 앞을 통과할 때 신호는 분석을 위해 결과 광음향 신호와 상호 연관될 수 있습니다. 10Hz의 샘플링 속도에서 레이저는 각 플러그를 여러 번 비춥니다.

그림 1. photoacoustic flow cytometry system 및 flow chamber의 대표적인 이미지.(A) 3D 프린팅된 플로우 챔버의 상세 보기. (B) PAFC 시스템 다이어그램. (C) 흐름 시스템 아키텍처 : SP = 주사기 펌프; DAQ/FPGA = 데이터 수집/필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이; Ob = 대물 렌즈; OF = 광섬유; FC = 파이버 커플러; UT = 초음파 변환기; FT = 흐름 탱크.