등뿌리 신경절 이식 및 해리된 세포 배양 생성

1. 성체 마우스의 DRG 외출 배양

1. 수집된 DRG를 3mL의 얼음처럼 차가운 무혈청 배지(SFM)가 들어 있는 35mm 페트리 접시에 넣습니다.
2. 각 DRG를 마른 유리 페트리 접시에 옮기고 수술용 현미경으로 블레이드를 사용하여 DRG에 아직 부착된 여분의 섬유와 결합 조직을 청소하고 잘라냅니다. DRG는 흰색 척추 신경/뿌리를 따라 불룩한 투명 구조로 쉽게 식별할 수 있습니다. DRG를 둘러싼 혈관은 종종 발견됩니다.
3. 세척된 DRG를 얼음처럼 차가운 SFM 매체가 들어 있는 새 페트리 접시에 넣습니다.
4. 젤라틴 단백질 혼합물(재료 표 참조)을 얼음처럼 차가운 SFM(1:1)에서 희석합니다.
5. 10/20 μL의 젤라틴 단백질 혼합물로 사전 코팅된 12웰 플레이트에 DRG를 생체외 플레이트로 플레이트화하고 30-60분 동안 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터 내부에 설정합니다.
6. 배양 시스템에 1.5-2mL의 SFM을 부드럽게 추가하여 전체 외식을 덮고 배양 조건(37°C 및 5% CO2)에서 외식을 유지합니다.
   메모: 이는 DRG가 중합된 젤라틴 단백질 혼합물에 의해서만 유리 접시에 고정되기 때문에 중요한 단계입니다. 중합 시간과 피펫팅 기술은 부유를 방지하는 데 매우 중요합니다.
7. 72시간마다 DRG가 증가하는 매체를 변경하고 필요한 만큼 DRG가 성장하도록 합니다.

2. DRG에서 단세포 뉴런 분리

1. 1.25mg/mL의 콜라겐분해효소 IV가 포함된 1.2mL의 F12 배지와 함께 1.5mL 멸균 튜브에 수집된 모든 DRG를 놓고 37°C 및 5% CO2에서 45분 동안 배양합니다. 첫 번째 배양 후 45분 동안 이 단계를 반복합니다.
2. 37°C 및 5% CO2에서 콜라겐분해효소 IV 처리 직후 30분 동안 트립신(0.025%)이 함유된 F12 배지 2mL로 외식제를 치료합니다.
3. 37°C 및 5% CO2에서 37°C에서 5% CO2를 함유한 F12 배지 2mL로 15분 동안 배양합니다.
4. 2mL의 F12 배지로 외식제를 3회 세척하고 배지가 흐려질 때까지 유리 피펫으로 기계적으로 해리합니다.
   메모: 이 절차에는 이전 섹션에서 설명한 것처럼 동물에서 깨끗한/손질된 DRG를 수집하는 작업이 포함됩니다. 외식의 기계적 해리를 수행할 때는 작업 재료의 유출 및 손실로 이어질 수 있으므로 부드럽게하고 과도한 힘을 가하지 마십시오.
5. 0.22μm 필터를 통해 해리된 세포 배양액을 여과하여 불순물과 과도한 결합 조직을 제거합니다. 여과된 세포를 (2,500 x g)에서 2분 동안 원심분리합니다.
6. 상층액을 제거하고 신경 배양(1x), 항생제 혼합물(1x), L-글루타메이트(0.5mM) 및 신경 성장 인자(5μg/mL)에 대한 보충제를 포함하는 500μL의 신경 기저 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다(재료 표 참조).
7. 해리된 세포를 선호하는 세포 밀도로 라미닌이 코팅된 커버 슬라이드(50μg/mL, 재료 표 참조)에 플레이트화합니다. 셀 카운터를 사용하여 셀 밀도를 확인합니다.
   메모: 우리는 25,000 셀/커버 슬라이드로 셀을 도금했습니다. 이 기술은 뉴런과 신경교세포(glial satellite cell)의 해리를 가능하게 합니다. 유사단극 뉴런(pseudounipolar neuron)과 함께 배양된 신경교세포(glial) 성분은 뉴런 생존에 중요한 역할을 합니다.