Method Article

Neuron Myelination을 위한 Schwann Cells와 Dorsal Root Ganglion Explant의 공동 배양

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Blusch, A. et al., 쥐 등뿌리 신경절 외식과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 체외 수초화. J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 등쪽 뿌리 신경절 이식과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 보여줍니다. 공동 배양 조건에서 아스코르브산은 슈반 세포가 수초화 형태로 분화되는 것을 촉진합니다. 슈반(Schwann) 세포는 축삭돌기를 여러 번 감싸 신경 기능에 필수적인 미엘린 수초(myelin sheath)를 만듭니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 슈반 세포 배양

  1. 슈반 세포 배양을 위한 코팅
    1. 멸균 상태에서 세포 배양 접시를 코팅합니다. 0.01% 폴리-L-라이신(PLL) 2mL를 각각 60mm 조직 배양(TC) 접시 2개에 적용하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    2. PLL을 제거하고 TC 접시를 증류수로 2번 씻고 4°C에서 하룻밤 동안 1μg/cm2 라미닌 2mL로 배양합니다. TC 접시를 아쿠아 데스트로 2번 씻고 접시를 자연 건조시킵니다.
  2. 슈반 세포 배양을 위한 배지 준비
    1. 멸균 조건에서 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium(DMEM)/F-12(고포도당)에 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS), 2μM 포스콜린, 10nM 뉴레굴린 및 50μg/mL 겐타마이신을 첨가하여 50mL의 Schwann 세포 배지를 준비합니다.
    2. 멸균 조건에서 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 Leibovitz의 L-15 배지 70mL를 준비합니다.
  3. 좌골 신경 준비
    메모: 모든 좌골 신경 준비 단계는 깨끗한 벤치에서 수행됩니다.
    1. Ca2+ 및 Mg2+가 없는 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL가 포함된 100mm TC 접시 1개, 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지 5mL와 함께 100mm TC 접시 1개, 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지 5mL 및 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 100mm TC 접시 1개를 준비합니다.
    2. 고압증기멸균으로 모든 기구를 청소하십시오. 기구와 작업 영역에 70% 에탄올을 분사합니다.
    3. 3주 된 수컷 Sprague Dawley 쥐 5마리를 CO2 흡입 및 참수를 사용하여 안락사시킵니다. 쥐의 몸통에 70% 에탄올을 뿌립니다.
    4. 등쪽 왼쪽 하지를 가위로 열고 대퇴 이두근을 조심스럽게 제거합니다. 구부러진 집게로 부드럽게 들어 올려 좌골 신경을 풀어 신경에 타박상을 입히지 않도록 합니다.
    5. 구부러진 집게로 신경의 가장 근위부를 잡고 신경을 곧게 펴고 가위를 사용하여 신경을 가능한 한 높게 자릅니다. 그런 다음 신경을 천골신경총과 발에 가까운 가위로 자른다. 오른쪽에 대해 1.3.4-1.3.5단계를 반복합니다.
      메모: 팔다리를 벌리는 동안 혈관에 멍이 들지 않도록 주의합니다.
    6. 집게를 사용하여 좌우 좌골 신경을 얼음처럼 차가운 DPBS가 있는 100mm TC 접시에 넣습니다.
  4. 좌골 신경 보수
    1. 겸자를 사용하여 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지 및 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 100mm TC 접시에 모든 신경을 전달합니다. 실체 현미경을 계속 사용하여 두 쌍의 미세한 집게로 신경에서 지방, 근육 및 혈관을 제거합니다. 집게로 신경을 잡고 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 미디엄을 사용하여 100mm TC 접시로 옮깁니다.
    2. 좌골 신경의 근위부와 원위부를 확인합니다. 근위부에서 원위 방향으로 한 쌍의 미세한 집게로 상부를 제거하고, 두 번째 쌍의 미세한 집게로 근위 신경 끝을 잡습니다.
    3. 정제된 신경을 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지 및 50μg/mL 겐타마이신이 함유된 100mm TC 접시로 옮깁니다. 두 쌍의 미세한 집게를 사용하여 단일 신경 섬유를 분리하고 분리하기 위해 분리된 신경 근막을 애타게 합니다.
    4. 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 신경 섬유를 50mL 튜브로 옮기고 가능한 한 적은 배지를 차지합니다. 50μg/mL 겐타마이신이 함유된 Leibovitz의 L-15 배지 50mL를 신경 섬유에 넣고 50mL 튜브에서 몇 번 슬루합니다.
  5. 좌골 신경의 효소 소화
    참고: 다음 단계(단계 1.5-1.8, 2.1 및 2.2)는 멸균 조건에서 수행됩니다.
    1. 10mL의 DMEM(고포도당)에 0.25% dispase II, 0.05% type I 콜라겐분해효소 및 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 효소 분해 용액을 준비합니다.
    2. 튜브를 188 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 25mL 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고, 1,000mL 피펫을 사용하여 나머지 Leibovitz의 L-15 배지와 함께 펠릿을 60mm TC 접시에 옮깁니다.
    3. 50mL 튜브를 효소 소화 용액 10mL로 헹구고 신경 섬유가 들어있는 접시에 넣으십시오. 소화를 위해 접근 가능한 표면을 최대화하기 위해 피펫 끝으로 접시에 조직을 조심스럽게 분배합니다.
    4. 37°C 및 5% CO2에서 18시간 동안 배양하고 Ca2+ 및 Mg2+(HBSS) 없이 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액에 10mL의 40% FCS를 첨가하여 분해를 중지합니다.
  6. 세포 분리
    1. 혈청학적 피펫과 원심분리기를 사용하여 4°C에서 10분 동안 188 x g의 원심분리를 사용하여 소화된 신경을 50mL 튜브로 옮깁니다.상등액을 버리고 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 10mL의 DMEM에 펠렛을 재현탁합니다. 이후 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL 및 200 μL 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 20회 재현탁합니다.
    2. 100μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하고 4°C에서 10분 동안 188 x g에서 원심분리합니다. 상등액을 버리고 10% FCS와 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 DMEM 4mL로 펠릿을 재현탁합니다.
    3. 두 개의 PLL 및 라미닌 코팅된 60mm TC 접시 각각에 2mL의 세포 현탁액을 추가하고 37°C 및 5% CO2에서 배양합니다. 인큐베이터에서 2일 동안 플레이트를 손대지 않은 상태로 두어 기계적 스트레스로부터 세포를 보호하고 접착력을 높입니다.
  7. Schwann 세포 분화
    1. 2일 후 배지를 제거하고 DMEM(고포도당), 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신으로 플레이트를 2x 조심스럽게 헹굽니다. 그 후, Schwann 세포 배지 2mL를 첨가합니다. 2일마다 Schwann 세포 배지를 교체하고 현미경을 사용하여 세포 모양과 포화도를 관찰합니다.
      참고: 슈반 세포와 DRG 외식은 공동 배양을 위해 시기적절하고 조정된 방식으로 준비해야 합니다. E 13.5의 배아를 가진 쥐가 Schwann 세포의 포화도가 80%에 가까울 때 DRG 준비에 사용할 수 있는지 확인하십시오.
  8. 세포 트립신화 및 자기 분리
    메모: 다양한 슈반 세포 배양 단계의 예시적인 그림은 그림 1을 참조하십시오.
    1. 세포가 약 80%의 포화도(배양 6-12일)에 도달하면 3mL의 DPBS로 플레이트를 2x 조심스럽게 세척하고 0.05% 트립신/EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 2mL(37°C로 예열)를 3분 동안 배양합니다. 세포가 플레이트 바닥에서 분리되면 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 DMEM 2mL를 첨가하여 분해를 비활성화합니다.
      메모: 엄격하게 3분의 트립신화 시간을 고수하고 그 후에 빠르게 진행하십시오.
    2. 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2nM EDTA가 포함된 DPBS를 함유한 2mL의 자기 세포 분리 완충액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루를 결합하고 염색 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.
    3. 4°C에서 10분 동안 188 x g에서 세포 현탁액을 원심분리하고 1 x 107 세포당 90μL의 자기 세포 분리 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 1 x 107 세포당 10μL의 Thy-1 마이크로비드를 추가합니다. 용액을 몇 번 재현탁시키고 8 ° C의 어둠 속에서 15 분 동안 배양합니다.
    4. 2mL의 자기 세포 분리 완충액을 세포 현탁액에 추가하고 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.상등액을 버리고 펠릿을 500μL의 자기 세포 분리 완충액에 재현탁합니다.
    5. 자기 세포 분리 컬럼을 1mL의 자기 세포 분리 버퍼로 적십니다. 자기 세포 분리 컬럼을 자기 세포 분리기에 놓습니다. 세포를 자기 세포 분리 컬럼에 적용합니다. 흐름을 수집하고 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리
      참고: 섬유아세포는 긍정적으로 선택되어 컬럼에 남아 있는 반면 Schwann 세포는 컬럼을 통과합니다. 섬유아세포는 스탬프(stamp)로 채취할 수 있습니다(예: 슈반(Schwann) 세포 염색 프로토콜에 대한 음성 대조군).
    6. 상등액을 버리고 공중 배양 배지 1mL에 펠렛을 재현탁합니다(단계 3.1.1 참조). 트리판 블루(trypan blue)와 염색 챔버(staining chamber)로 염색한 후 세포를 세어봅니다.

2. DRG 외식 배양

  1. DRG 성장 배지 준비
    1. 신경기저 배지에 2% B27, 2% 호스 세럼, 1% L-글루타민, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 및 10ng/mL 신경 성장 인자(NGF)를 첨가하여 DRG 성장 배지를 준비합니다. 성장 배지를 4 °C.
      에 보관하십시오. 참고: 성장 배지는 2일 동안 사용할 수 있습니다.
  2. DRG 외식용 코팅
    1. 커버슬립을 70% 에탄올에 1시간 동안 배양하고 구부러진 집게를 사용하여 4웰 접시의 웰에 넣습니다. 에탄올이 건조된 후 웰당 300μL의 0.2mg/mL 폴리-D-라이신(PDL)을 도포하고 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양합니다.
    2. DPBS로 커버슬립을 3분씩 연속적으로 5회 세척합니다. DPBS를 제거하고 커버슬립에 1μg/mL 라미닌 300μL를 도포한 다음 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양합니다.
    3. DPBS로 5분 동안 3단계 세척한 후 DPBS를 190μL의 DRG 성장 배지로 교체합니다. 4웰 플레이트를 37°C 및 5% CO 2의 인큐베이터에 넣습니다.
  3. DRG 준비
    참고: 깨끗한 벤치에서 배아 쥐의 DRG를 수확하십시오.
    1. 준비하기 전에 모든 기구를 70% 에탄올로 세척하십시오. 접시당 10개(배아당 2개)의 35mm TC 접시에 2mL의 얼음처럼 차가운 HBSS를 채우고, 접시당 5mL의 얼음처럼 차가운 HBSS로 100mm TC 접시 2개를 채웁니다.
    2. 임신한 쥐(성체 암컷 Sprague Dawley 쥐, E13.5)를 CO2 흡입 및 참수로 안
      3. 락사시킵니다.
    3. 몸에 70 % 에탄올을 뿌리고 쥐의 복부 몸통을 엽니 다. 조심스럽게 자궁을 제거하고 얼음처럼 차가운 HBSS가 있는 100mm TC 접시에 넣습니다.
    4. 구부러진 집게를 사용하여 자궁을 잡고 가는 집게로 자궁벽을 엽니다. 양수 주머니 하나를 제거하고 가는 집게로 구멍을 꼬집어 조심스럽게 엽니다.
    5. 주변 조직에서 배아를 제거하고 탯줄을 자르고 가는 집게를 사용하여 배아의 목을 베십시오. 곡선형 집게와 주걱을 사용하여 HBSS로 채워진 100mm TC 접시에 몸통을 놓습니다.
    6. 자궁에서 모든 배아를 신속하게 제거하고 HBSS로 채워진 하나의 100mm TC 접시에 이식합니다. 배아가 5개 이상인 경우 2.3.1단계에 따라 HBSS 2mL가 포함된 35mm TC 접시를 추가로 준비합니다.
    7. 주걱과 구부러진 집게를 사용하여 HBSS로 채워진 35mm TC 접시에 배아 몸통 하나를 부드럽게 넣습니다. 실체현미경으로 몸통의 등쪽 부분을 열어 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 배아를 두 반으로 나눕니다. 절반을 옆으로 돌리고 배아의 등쪽 부분에서 일렬로 위치한 DRG 가닥을 식별합니다.
    8. 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 DRG 가닥을 전체적으로 자릅니다. HBSS 2mL로 채워진 새 35mm TC 접시에 DRG를 넣고 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 나머지 조직에서 단일 DRG를 분리합니다.
  4. DRG 세포 배양
    1. 190μL의 DRG 성장 배지가 들어 있는 4웰 플레이트를 인큐베이터에서 DRG를 준비할 클린 벤치로 가져갑니다. 단일 DRG를 가는 집게와 주걱을 사용하여 4웰 배양 플레이트의 한 웰로 조심스럽게 옮깁니다. DRG를 부착하려면 중앙 위치가 중요하므로 DRG를 각 웰의 중앙에 배치합니다.
    2. 이제부터 무균 상태에서 작업하십시오. 외식 배양액을 37 ° C 및 5 % CO2의 인큐베이터에 놓습니다. 다음 날, 100mL 피펫을 사용하여 각 웰에 50μL의 DRG 성장 배지를 조심스럽게 추가합니다.
    3. 매일 현미경을 사용하여 DRG 외식증 부착 및 축삭 성장기를 관찰하고, 배양 3일차에 커버슬립에서 분리되거나 축삭돌기를 능가하지 못한 DRG 외식식물을 폐기합니다.
      참고: DRG 외식은 배양 첫날에는 매우 약하며 특히 배지가 변경될 때 또는 인큐베이터 도어를 닫을 때도 인큐베이터 안팎으로 플레이트를 이동할 때 주의해서 다루어야 합니다. 웰당 190μL의 배지의 정확한 부피는 배양 첫날 동안 DRG 외식을 제자리에 유지하는 데 매우 중요합니다. 느슨한 DRG 외식은 커버슬립에 달라붙는 대신 배지에서 수영하기 때문에 일일 제어 중에 쉽게 식별할 수 있습니다.

3. 공동 문화

  1. Schwann 세포를 DRG explant 배양으로 옮김
    1. DRG 성장 배지에 0.1% 아스코르브산을 첨가하여 공동 배양 배지를 준비합니다.
    2. DRG 외식 배양 3일차에 DRG 성장 배지를 웰당 30,000개의 Schwann 세포(1.8단계부터)를 포함하는 250μL의 공동 배양 배지로 조심스럽게 교체합니다.
    3. DRG 외식과 슈반 세포의 공동 배양을 최대 22일 동안 유지합니다. 격일로 250μL의 공동 배양 배지를 조심스럽게 교체하고 현미경을 사용하여 세포의 모양을 관찰합니다.
      참고: 배양 첫날에 공동 배양에서 DRG 축삭돌기 및 슈반 세포의 예는 그림 2를 참조하십시오.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
그림 1: 슈반 세포 배양 단계. 자기 세포 분리 전과 (B) 배양된 Schwann 세포의 예시적인 명시야 사진. 자기 세포 분리 전, 배양액에는 길쭉한 방추체 형태의 슈반 세포, 평평하고 넓게 퍼진 섬유아세포, 결합 조직의 잔해가 포함됩니다. 슈반 세포를 보다 순수하게 배양하기 위해 자기 세포 분리가 수행됩니다. 스케일 바 : 200 μm.

figure-results-2
그림 2: 배양에서 슈반(Schwann) 세포와 축삭돌기의 출현.3일차 공동 문...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아스코르브산 Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 A4403-100MG
B27-보충제Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 제17504-044
바이오스피어 필터 팁, 100 μLSarstedt, Nümbrecht, 독일 70760212
바이오스피어 필터 팁, 1250 μLSarstedt, Nümbrecht, 독일 701186210
바이오스피어 필터 팁, 20 μLSarstedt, Nümbrecht, 독일 701114210
바이오스피어 필터 팁, 300 μLSarstedt, Nümbrecht, 독일 70765210
소 혈청 알부민Carl Roth, 독일 카를스루에 8076.4
셀 스트레이너, 100 μMBD Bioscience, 하이델베르크, 독일제352360
원심분리기 5810-REppendorf AG, 함부르크, 독일5811000015
CO2 인큐베이터 HeracellHeraeus Instruments, 하나우, 독일 51017865
커버슬립 12mmCarl Roth, 독일 카를스루에 231.1
곡선형 가는 집게 Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일11370-42
디스플레이 IISigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 4942078001
증류수(정수 시스템) Millipore, Molsheim, 프랑스ZLXS5010Y
DMEM/F-12, 글루타맥스Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 31331093
DPBS(Ca2+ 및 Mg2+ 없음)Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 D8537-6X500ML
에탄올 VWR, 래드너, 미국 1009862500
증권 시세Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 F7524FCS는 슈반 세포 배양을 위해 테스트해야 합니다
가는 집게(Dumont #5)Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일11252-20
집게Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일11370-40
포스콜린Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 F6886-10MG
겐타마이신Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테5710064
HBSS(Ca2+ 및 Mg2+ 없음) Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 14170138
HER세포 인큐베이터Heraeus Instruments, 하나우, 독일 51017865
헤라가드 에코 1.2Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 51029882
호스 세럼Pan-Biotech, Aidenbach, 독일P30-0712
라미닌Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 L2020-1MG
레보비츠의 L-15 미디엄Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 11415064
L-글루타민 200 mM Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 25030024
MACS 멀티스탠드 Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일130042303
마이크로 가위Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일15000-08
현미경 Motic, Wetzlar, 독일모틱 BA 400
현미경 Axio observer 7Zeiss, 독일 오버코헨 제491917-0001-000
현미경 슬라이드VWR, 래드너, 미국 630-1985
MiniMACS 분리기Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일130091632
MS 컬럼Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일Tel.: 130-042-201
노이바우어 계수 챔버 어시스턴트, 독일 에를랑겐40441
뉴레굴린Peprotech, Rocky Hill, 미국100-03
Neurobasal 배지 Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 21103049
증권 시세Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 N1408
노멀 염소 세럼Biozol, Eching, 독일S-1000
Nunclon 멀티디쉬, 4웰Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 D6789
파라포름알데히드Acros Organics, 미국 뉴저지 10342243
페니실린/스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 15140-122
피펫보이Eppendorf AG, 함부르크, 독일4430000018
피 펫Eppendorf AG, 함부르크, 독일2231300004
폴리 -D-라이신Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 P6407-5MG
폴리-L-라이신Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 P4707-50ML
반응 튜브, 15 mLSarstedt, Nümbrecht, 독일 62554502
반응 튜브, 50 mLSarstedt, Nümbrecht, 독일 62547254
반응 용기, 1.5 mLSarstedt, Nümbrecht, 독일 72690001
안전 캐비닛 S2020 1.8Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 51026640
가위Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일14083-08
혈청학적 피펫, 10 mLSarstedt, Nümbrecht, 독일 861254025
혈청학적 피펫, 25 mLSarstedt, Nümbrecht, 독일 861685001
혈청학적 피펫, 5 mLSarstedt, Nümbrecht, 독일 861253001
주걱Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일10094-13
실체현미경 Discovery.V8Zeiss, 독일 오버코헨 제495015-0012-000
수술용 가위Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일14007-14
TC 접시 100, 셀 +Sarstedt, Nümbrecht, 독일 833902300
TC 접시 35, 셀 +Sarstedt, Nümbrecht, 독일 833900300
TC 접시 60, 셀 +Sarstedt, Nümbrecht, 독일 833901300
Thy-1 마이크로비즈(MACS 키트)Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일Tel.: 130-094-523
Trypan 블루 솔루션 0.4% Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 15250061
트립신 (2.5 %), 페놀 레드 없음Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 제15090-046
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 제25300-054
유형 I 콜라겐 분해 효소Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 C1639
수조 유형 1008GFL, 부르크베델, 독일 4285
호 조 페이지 년 표시기 . 년 년 년 호 년 년 표시기 시리즈 년 년 년 호 년 호 호 년

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