마우스 해마의 세타 진동에 대한 시험관 내 기록

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.                                                                                      

1. 급성 해마 체외 준비

참고: 온전한 해마 제제를 분리하려면 (1) 용액 및 장비 준비, (2) 해마 해부 및 (3) 고유 세타 진동 생성에 필요한 빠른 관류 속도 시스템 설정의 세 가지 주요 단계가 포함됩니다. 이 프로토콜에서는 분리된 해마가 밀도가 높지만 섬세한 준비를 구성하기 때문에 in vitro 구조의 기능적 연결성을 유지하는 데 세심한 주의가 필요하기 때문에 절개에서 기록에 이르기까지 절차의 적시 수행이 특히 중요합니다. 모든 것을 미리 준비하면 세포 손상을 최소화하고 생리적 기능을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 적절한 수준의 관류를 사용할 수 있습니다.

1. 자당 기반 인공 뇌척수액(aCSF) 용액
   1. 박리 및 박리 후 배양에 사용할 1X 스톡 자당 용액을 준비합니다. CaCl₂를 제외한 표 1에 나열된 모든 성분을 1L의 탈이온수에 결합하고 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
2. 표준 aCSF 솔루션
   1. 전기생리학적 기록 중 분리된 해마의 높은 유속 관류를 위해 표준 aCSF를 준비합니다. 농축(5X) 원액을 aCSF로 만들려면 CaCl₂를 제외한 표 2에 나열된 모든 성분을 탈이온수 2L에 용해하고 4°C에서 보관하십시오.
3. 장비 준비
   1. 해부를 시작하기 전에 얼음으로 채워진 플라스틱 트레이(30 x 20 x 5cm), 발암제 연결 튜브 라인 및 3개의 유리 페트리 접시(10 x 2cm)로 벤치 영역을 설정합니다(그림 1 참조).
   2. 500mL 비커에 300mL의 자당 용액(1X 스톡)을 넣고 탄수화물(95% O₂, 5% CO₂)로 거품을 낸 다음 Ca₂+[1.2mM]를 추가합니다.
   3. 이 자당 용액 60mL를 유리 페트리 접시에 옮기고 실온에 둡니다. 나머지는 4 °C 냉동고에 10 - 15 분 동안 넣습니다.
   4. 얼음처럼 차가운 자당 용액에 탄수화물을 해부 전체에 거품을 냅니다.
   5. 두 번째 페트리 접시(냉장 보관실)에 자당 용액(4°C)을 채우고 얼음 위에 보관합니다.
   6. 30mL의 비커에 얼음처럼 차가운 자당 용액 50mL를 추가합니다.

2. 전체 해마 해부

참고: 고립된 해마를 해부하는 방법은 원래 개발 및 설명된 방법과 본질적으로 동일하지만 관류 속도 및 기록 기술에 대한 추가 세부 사항 및 변경 사항이 있습니다.

1. 뇌 해부
   1. 케이지에 1mL의 이소플루란(100%)을 적신 작은 종이 타월로 흄 후드 아래에서 마우스를 마취합니다.
   2. 마취된 마우스의 목을 베고 머리를 얼음처럼 차가운 자당 용액(50mL 비커, ~ 5초)에 빠르게 담그십시오. 종이 타월 위에 옮깁니다.
   3. 메스를 사용하여 내측 피부를 절개하고(꼬리에서 꼬리까지) 옆의 피부를 밀어 두개골이 드러나도록 합니다.
   4. 작은 가위로 두개골을 잘라 열고 주걱을 사용하여 뇌를 빠르게 추출하여 얼음처럼 차가운 자당 용액이 담긴 페트리 접시에 떨어뜨립니다. 뇌가 식을 때까지 1-2분 정도 기다립니다.
   5. 뇌가 회복하는 동안 2 - 3 mL의 자당 용액을 얼음 위의 렌즈 종이로 덮인 페트리 (해부) 접시에 넣으십시오.
2. 해마를 분리하기
   1. 뇌를 해부 접시에 똑바로 세웁니다.
   2. 면도날로 소뇌와 전두엽 피질을 제거합니다. 시상면(midsagittal plane)을 따라 뇌를 반으로 자르고 두 개의 고립된 반구를 보전실(holding chamber)로 되돌립니다. 회복을 위해 1 - 2분 정도 더 기다립니다.
   3. 반구가 있는 뇌 하나를 해부 접시 위에 똑바로 세웁니다.
   4. 시상(半道) 구조가 관찰자를 향하고 중격 복합체의 내장된 윤곽이 시상 앞쪽에 있는 얇은 배 모양의 조직층으로 보일 때까지 접시를 회전시킵니다.
   5. 마이크로 주걱으로 반쪽이 절제된 뇌를 안정적으로 잡고 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로 코팅된 주걱의 작은 끝을 중격 부위 바로 뒤(꼬리쪽)에 놓습니다.
   6. 코팅된 주걱을 격막 아래에 삽입하고 절개 접시에 닿을 때까지 팁을 아래로 움직입니다. 꼬리 쪽으로 중격 부위를 연결하는 섬유를 절단합니다. 중격의 앞쪽 가장자리를 따라 동일한 작업을 반복하고 뇌의 전두엽에 연결된 섬유를 자릅니다.
   7. 주걱으로 해마 바로 위의 피질 안쪽 부분을 똑바로 세운 상태에서 마이크로 주걱을 사용하여 시상핵, 시상하부, 남아 있는 뇌간핵을 조심스럽게 아래로 당깁니다. 그런 다음 주걱을 사용하여 당겨진 조직을 잘라 제거합니다.
   8. 고립된 반구를 옆으로 돌려 해마의 윤곽을 확인합니다.
   9. 코팅된 주걱을 등쪽 해마의 상부 끝 아래 외심실에 삽입합니다.
   10. 반절제된 뇌의 시상면과 수평으로 정렬된 주걱을 잡고 끝이 꼬리 방향으로 나올 때까지 심실 벽의 부드러운 윤곽을 통해 밀어 넣습니다.
   11. 해마 아래에 주걱을 잡고 해마가 위에 있는 피질과 합류하는 내부층을 따라 연결 섬유에 가볍게 누릅니다. 이 층의 바깥쪽에 마이크로 주걱을 바르고 코팅된 주걱에 대고 밀어 연결 섬유를 자릅니다.
   12. 추출을 완료하려면 해부 접시를 회전시키고 코팅된 주걱을 복부 해마 아래에 삽입합니다. 주걱으로 피질 주름 내부를 가볍게 잡고 마이크로 주걱에 대해 슬라이스 동작을 사용하여 내후 연결을 절단합니다.
       메모: 전체 해마 아래에 코팅된 주걱을 놓고 아래에 남아 있는 뇌 조직을 뽑아내면 전체 중격 해마 복합체를 제거할 수 있습니다.
   13. 분리가 완료되면 해마를 접시 위에 올려 놓고 얼음처럼 차가운 자당 용액 한 방울을 넣어 시원하게 유지합니다. 남아있는 피질과 섬유를 조심스럽게 잘라내고 면도날을 fornix.
       에 부드럽게 적용하여 중격에서 해마를 분리합니다. 메모: 피라미드 세포에서 패치 클램프 기록을 수행해야 하는 경우, 고립된 해마를 45° 각도로 가로로 절단하여 해마의 나머지 부분에 있는 국소 네트워크 회로를 손상시키지 않으면서 Cornu Ammonis(CA)1의 피라미드 층을 노출시킬 수 있습니다("앵글 컷" 준비).
   14. 제제를 실온의 자당 용액으로 옮기고 기록 챔버로 옮기기 전에 15 - 30분 동안 회복되도록 합니다.

3. 고립된 해마를 기록하기 위한 빠른 관류 설정

1. 20 - 25mL/분의 속도로 산소화된 aCSF가 지속적으로 고속 유입될 수 있도록 중력 공급 관류 시스템을 설정합니다.
   1. aCSF(1X) 플라스크를 미리 준비하고 실험 시작 최소 15분 전에 온열 수조(~30°C)에 담그십시오. 인라인 용액 히터 시스템(30°C)을 켭니다.
   2. 탄수화물 탱크에 연결된 수족관 버블러와 튜빙 라인을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 aCSF에 산소를 공급하고 관류를 시작하기 전에 CaCl₂[2mM]를 추가합니다.
   3. aCSF 흐름을 중지하고 유리 피펫의 넓은 끝을 사용하여 해마를 기록 챔버로 이동합니다. 자당이 포화 된 제제가 바닥에 가라 앉고 가라 앉도록하십시오.
   4. 준비제를 CA1 및 SUB의 매끄러운 표면이 위에 오도록 하여 기록실 중앙(입구-출구 축과 일직선
   상)에 놓습니다.
   5. 중격 및 측두엽 말단에서 작은 무게로 해마를 안정화하고 aCSF 흐름을 다시 시작합니다.

4. 고립된 해마의 전기생리학

1. in vitro hippocampal theta oscillations의 세포외 기록
   1. 체외에서 분리된 해마에서 LFP(Local Field Potential) 또는 단일 단위 활동의 세포 외 모니터링을 위해 aCSF로 채워진 유리 마이크로피펫(1 - 3MΩ)을 사용합니다. 이득 x1000의 패치 클램프 증폭기, 0.1 - 500Hz의 온라인 대역 통과 필터링 및 5-20kHz의 샘플링 속도를 사용하여 저잡음 AC 결합 전계 전위 신호를 기록합니다.
      메모: 이 프로토콜에 사용된 맞춤형 현미경에는 저배율(2.5X) 및 고배율(40X) 대물렌즈가 장착되어 있어 해마를 저배율로 볼 수 있으며, 적외선 비디오 현미경 및 단세포 인식을 위한 형광(epifluorescence)도 있습니다. 이 시스템의 구성 요소에는 정립 형광 현미경, 형광 필터 큐브, 아날로그 비디오 카메라 및 이미징 소프트웨어가 있는 디지털 프레임 그래버, 무대 위의 맞춤형 관류 챔버(그림 2A, 삽입 i) 및 신경 기록 및 광섬유 배치를 위한 고정밀 마이크로 매니퓰레이터가 포함됩니다.
   2. 현미경에 장착되고 컴퓨터 디스플레이에 연결된 카메라를 사용하여 저배율(2.5X)에서 해마 준비물을 검사하고 외부 표면에 언더컷이나 손상이 없는지 빠르게 확인합니다. CA1의 매끄러운 표면을 따라 대각선 방향의 폐포 섬유 배열은 해마를 통해 투과광을 비출 때 볼 수 있어야 합니다(그림 2A, 삽입 ii).
   3. 저배율 광시야 대물렌즈를 사용하여 고립된 해마와 특정 기록 위치에 LFP 전극의 배치를 확인합니다.
      메모: 서로 다른 기록 위치에 배치된 여러 전극을 갖는 분리된 해마 제제의 레이아웃이 그림 2A에 예시되어 있습니다.
   4. CA1 영역의 표면(폐포)에 닿을 때까지 LFP 전극을 수조로 내립니다.
      메모: 이것은 일반적으로 전극이 기록 매체와 접촉할 때 발생하는 것과 유사하게 AC 결합 기록에서 빠른 과도 현상을 생성합니다. 오디오 모니터는 이 단계 후에 LFP 채널 신호를 듣는 데 유용할 수 있습니다.
      메모: 종종 활동의 초기 징후는 10-15분 후에만 나타나므로 준비를 빠르게 진행하지 않는 것이 중요합니다. 이 기간이 지난 후에도 표면 LFP 전극이 여전히 활성을 감지하지 못하면 오리엔층을 통해 조금 더 아래로 전진하고 주기적으로 일시 중지하여 주 세포층에 접근하는 동안 어떤 형태의 활성이 발생하는지 확인합니다. 5 - 10분 후에도 아무 것도 감지되지 않으면 전극을 조심스럽게 집어넣고 동일한 영역을 따라 다른 곳에 놓습니다.
   5. 피라미드 층을 통해 LFP 전극을 전진시킵니다. 세포 외 스파이크 활성은 개별 뉴런(대부분 피라미드 및 억제성 바구니 세포)에서 단일 단위 방전이 감지됨에 따라 초기에 증가하는 것을 관찰합니다. 전극을 더 낮추고 팁이 반경으로 교차할 때 스파이크가 다시 사라지기 시작하는 점에 유의하십시오. 세타 주파수 범위(4 - 12Hz)에서 명확하게 보이는 네트워크 진동이 뚜렷해지고 기록 위치가 반경을 통해 낮아짐에 따라 최대 진폭(~100 - 300μV)에 도달하는 것을 관찰합니다.
2. 단일 영역에 걸친 세타 진동
   1. CA1 영역을 가로지르는 자발적인 세타 진동의 공간적 특성을 테스트하려면 기준 LFP 전극의 끝을 내측 CA1 위치(세로 중격-측두축을 따라 중앙으로 위치)에 배치하고 앞에서 설명한 대로 요골 내측으로 내립니다.
   2. 두 번째 LFP 전극을 CA1 위치(첫 번째 LFP에서 200 - 800μm 중격 또는 측두)에 놓고 CA1 세타 진동이 상대적으로 먼 거리에서 동기화될 수 있는지 관찰합니다.
3. 레이어 전반에 걸친 세타 진동
   1. 해마층을 가로지르는 세타 진동의 특성을 테스트하려면 CA1 방사선 부위에 기준 LFP 전극을 남겨 두십시오. 오리엔스층(stratum oriens) 바로 위에서 시작하여 두 번째 전극을 피라미드 세포층으로 낮추고 방사상(radiatum)을 통과합니다. 피라미드 층에서 LFP 신호의 점진적인 반전(상대 위상 반전)을 관찰합니다.
      메모: 이러한 유형의 활동에 대한 대표적인 예는 그림 2B를 참조하십시오. 고립된 해마의 위상 반전 부위를 보여주는 층류/깊이 프로파일 및 CSD(Current Source Density) 분석의 예는 이전에 발표되었습니다.

표 1.

표 2.

그림 1: 분리된 온전한 해마 제제를 위한 해부 절차.

(a) 해부 설정의 일반적인 모습. 오른쪽 위: 발암된 얼음-차가운 자당 용액 플라스크 (1); 왼쪽 하단: 렌즈지로 덮인 해부 접시를 들고 있는 얼음이 채워진 플라스틱 트레이(2)(3); 자당 용액 (4)을 함유하는 냉간 보유 챔버; 및 수술 도구 세트(5). (b) 해부 접시의 반절제 전 마우스 뇌의 모습. (c) 냉장 보관실에서 반절제된 뇌를 회복하고 코팅된 주걱의 작은 끝을 중격 아래에 삽입하기 전에 좌뇌 반구의 확대/축소 보기(삽입). (d) CA1/SUB 영역을 따라 고립된 해마 아래에 놓인 코팅된 주걱을 나머지 뇌 조직과 함께 아래에서 뽑아냅니다.

그림 2: 수중 기록 챔버에서 온전한 해마 제제의 체외 세타 진동을 기록하기 위한 설정 구성.

(a) 고립된 해마는 해마 영역의 레이아웃과 중격 측두엽으로 분포된 4개의 서로 다른 기록 부위에 배치된 여러 전극(흰색 별표로 표시)으로 표시됩니다. 위에 표시된 기록 챔버 플랫폼(삽입 i)의 보기에서 빠른 관류 흐름을 위한 입구와 출구는 숫자(1, 2)로 표시됩니다. 아래에 표시된 해마의 확대 이미지(삽입 ii)에서는 단일 전극이 중측두엽 CA1에 배치되어 있으며 폐포의 섬유가 하측두를 향해 대각선으로 뻗어 있습니다. S: 격막, T: 측두, f/fx: fimbria-fornix. (b) 오리엔층(회색) 및 방사층(검은색)에서 동시에 기록된 대표적인 LFP 흔적이 있는 CA1 층 조직의 개략적 표현. 두 계층 사이의 신호가 역위상으로 나타난 것을 볼 수 있습니다. Alv: 폐골 지층, PR: 피라미드 지층, SR: 요골 지층. SLM: Lacunosum 분자 지층. (c) 필터링되지 않은 신호로부터 CA1/SUB 영역(20초 세그먼트) 및 2초 확장 세그먼트(아래)에서 기록된 자발적인 세타 진동을 보여주는 LFP 추적의 예; 세타 주파수(0.5 - 12Hz)에 대해 필터링된 대역 통과; 느린 감마(25 - 55Hz); 및 빠른 감마(125 - 250Hz).