성체 초파리 파리의 관통 외상성 뇌 손상 유도

1. 관통성 외상성 뇌 손상(PTBI; 그림 1)

1. 새로 닫힌 F1 플라이를 정렬합니다. 폐쇄 후 6시간 이내에 어린 수컷을 선택합니다. 이 수컷을 음식이 들어 있는 깨끗한 유리병에 넣고 유리병당 40마리 이하의 파리를 넣습니다.
   참고: 이것은 CO₂ 패드에서 파리를 마취하고 내장에 아직 태변(복벽을 통해 짙은 녹색 반점으로 보임)이 있는 성인 수컷을 식별하여 오전 중반에 가장 쉽게 달성할 수 있습니다.
2. 70% 에탄올로 채워진 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 ~100개의 핀을 넣어 Minutien 핀(재료 표 참조)을 최소 5분 동안 소독합니다.
3. CO₂ 패드와 페인트 브러시를 70% 에탄올을 분사하여 소독하고 깨끗하고 보푸라기가 없는 티슈로 물기를 닦아냅니다. 도구가 깨끗하고 건조되면 40개 이하의 분류된 F1 수컷을 깨끗한 패드로 다시 옮깁니다.
4. 플라이 패드에서 F1 수컷을 2개 그룹으로 분리합니다. 한 그룹은 다치지 않은 파리를 통제하는 역할을 합니다. 두 번째 실험 그룹은 PTBI를 투여받게 됩니다.
5. 집게를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 4-5개의 새 Minutien 핀을 당겨 CO₂ 패드 가장자리 근처에 놓습니다. 해부 범위에서 뾰족한 점이 있는 직선 Minutien 핀을 선택합니다.
   참고: 실험에 단일 Minutien 핀을 사용하면 변동성을 줄일 수 있습니다. 날카로운 핀을 재사용하십시오. 안전한 폐기를 위해 70% 에탄올이 들어 있는 별도의 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 손상되거나 뭉툭한 핀을 넣습니다.
6. 표준 십자가에서 파리로 작업하는 경우 녹색 형광 단백질(GFP)에 적합한 여기 및 방출 필터가 장착된 실체 현미경 발광 다이오드(LED) 램프를 켭니다. 이를 통해 440-460nM에서 여기(excitation)가 가능하고 500-560nM의 시각화가 가능합니다.
   참고: 이 램프와 필터 세트를 사용하면 버섯체의 세포체가 머리 표피를 통해 녹색으로 형광을 발합니다(그림 1C). perma-twin 파리 또는 다른 유전자형의 파리의 경우, 실체 현미경용 표준 백색광 조명기를 사용하여 버섯 몸체의 손상을 목표로 하는 머리 표피의 랜드마크를 시각화할 수 있습니다(그림 1C).
7. 집게를 사용하여 선택한 Minutien 핀을 한 손(오른손잡이의 경우 일반적으로 오른손)과 다른 손(일반적으로 왼손)의 붓을 집어 듭니다. 실험 그룹에서 파리 한 마리를 선택하고 파리의 머리가 오른쪽에 있는 머리 캡슐의 등쪽 보기가 되도록 파리를 배치합니다. 브러시를 등쪽 흉부 앞쪽에 놓고 부드럽게 눌러 파리를 안정시킵니다.
8. Minutien 핀의 끝을 머리 오른쪽에 있는 버섯 몸체의 세포체에 조준하고 머리 캡슐을 관통합니다. 랜드마크를 사용하는 경우 ocelli와 눈의 등쪽 가장자리 사이의 등쪽 머리 큐티클을 대상으로 합니다(그림 1).
9. 부상을 입은 후 페인트 브러시를 사용하여 Minutien 핀에서 머리를 부드럽게 밀어냅니다.
10. RNA-Seq 또는 qRT-PCR에 뇌를 사용하는 경우 머리 왼쪽에 두 번째 부상을 입힙니다.
11. 2.8-2.10단계를 반복하여 실험 그룹의 모든 파리를 다치게 합니다.
12. 모든 파리가 부상을 입으면 대조군과 부상당한 파리를 음식이 들어 있는 레이블이 지정된 별도의 바이알에 넣습니다. 파리가 마취에서 회복하는 동안 그리고 파리가 음식에 걸리지 않도록 후속 숙성 동안 바이알을 수평으로(즉, 옆으로) 놓으십시오.
13. 표준 교차 파리는 25 ° C에서, 영구 쌍둥이 파리는 30 ° C에서 나이를 먹습니다.
14. 24시간 이상 된 파리의 경우 1-2일마다 깨끗한 음식에 먹이십시오.

그림 1: 성인 초파리 중추 뇌에 침투하는 외상성 뇌 손상(PTBI). (A) 성인 플라이 헤드의 외관 개략도. 이것은 정면도입니다. 따라서 동물의 오른쪽은 관찰자의 왼쪽에 있습니다. (B) 회색으로 표시된 부상 궤적이 있는 성인 초파리 머리의 내부 개략도. 이것은 사후 뷰입니다. 따라서 이 이미지와 후속 그림에서 뇌의 오른쪽은 오른쪽에 있습니다. 중추 뇌 PTBI는 버섯 몸체(녹색)와 지방체(파란색) 및 혈구(빨간색)를 포함한 뇌 외부 조직을 포함한 여러 뇌 구조에 영향을 미칩니다. CB = 중추 뇌 영역. OL= 시신경 영역. (C) 버섯 몸체(화살촉)가 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 살아있는 성인 머리의 등쪽 모습. 이것이 '표준 유전자형'입니다(자세한 내용은 텍스트 참조). PTBI 프로토콜은 재현 가능한 방식으로 버섯 몸체에 손상을 입힙니다.