Summary
Basofielen activatie test is een krachtig instrument voor de detectie van IgE-afhankelijke allergie
Abstract
Overgevoeligheidsreacties tegen niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) zoals propyphenazone (PP) en diclofenac (DF) kan zich manifesteren als Type I-achtige allergische reacties: 1. In de klinische praktijk, is de diagnose van overgevoeligheid voor geneesmiddelen voornamelijk uitgevoerd door de patiënt, als de huid test is niet betrouwbaar en mondelinge provocatie testen draagt levensbedreigende risico's voor de patiënt 2. Vandaar dat bewijs voor een onderliggende IgE-gemedieerde pathomechanisme is moeilijk te verkrijgen.
Hier presenteren we een in-vitro-methode, gebaseerd op het gebruik van menselijke basofielen afgeleid van geneesmiddel-overgevoelige patiënten die de allergische reactie effector in vivo nabootst. Als basofielen van drug-allergische patiënten altijd IgE-moleculen die specifiek zijn voor de dader drug, worden ze geactiveerd bij IgE-receptor verknoping en laat allergische effector-moleculen. De activering van basofielen kan gevolgd worden door de bepaling van de opregulatie van CD63 oppervlakte expressie met behulp van flowcytometrie 3.
In het geval van een laag moleculair gewicht drugs, zijn conjugaten ontworpen om IgE-receptor verknoping mogelijk op basofielen. Zoals weergegeven in figuur 1, twee vertegenwoordigers van NSAID's, PP en DF, zijn covalent gebonden aan humaan serumalbumine (HSA) via een carboxylgroep reageren met de primaire aminogroep van lysine residuen. DF draagt een intrinsieke carboxylgroep en dus direct 4 worden gebruikt, terwijl een carboxylgroep bevattende afgeleide van PP moest organochemically worden gesynthetiseerd voorafgaand aan de studie 1.
De koppeling mate van de laagmoleculaire verbindingen op het eiwit dragermolecuul en hun ruimtelijke verdeling is belangrijk te garanderen verknoping van twee IgE receptor moleculen. De hier beschreven protocol is van toepassing high performance-size exclusion chromatografie (HPSEC) uitgerust met een sequentiële brekingsindex (RI) en ultraviolet (UV) detectie systeem voor de bepaling van de koppeling graad.
Zoals de beschreven methodiek kan worden toegepast voor andere geneesmiddelen, de basofielen activatie test (BBT) draagt de potentie om gebruikt te worden voor de bepaling van IgE-gemedieerde mechanismen in drug overgevoeligheid. Hier bepalen we PP overgevoeligheid als IgE-gemedieerde en DF overgevoeligheid als niet-IgE-gemedieerd door BAT.
Protocol
1. Voorbereiding van de drug conjugaten
- Los 10 mg DF in 1 ml dH 2 O in een 1,5 ml reactie buis. Bij de verdere procedure gebruik 95 ul van deze DF oplossing. Om conjugaat PP aan HSA te ontbinden 30,4 mg PP afgeleide (304 g / mol) in 500 pi 0,3 M natriumhydroxide (NaOH).
- Voeg 430,6 ul dH 2 O en 100 ul 0,5 M 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur (MES) buffer pH 6,5 tot 95 ul van de opgeloste DF. Voeg 33,1 ul dH 2 O en 140 ul van 2 M MES buffer pH 2,9 tot de PP monster.
- Voeg 57,5 ul van een vers bereide N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) voorraadoplossing opgelost in dH 2 O met een concentratie van 100 mg / ml voor de DF monster, of 10 ul EDC oplossing voor de PP monster. Vortex de monsters gedurende 1 minuut.
- Voeg 16,9 ul van HSA oplossing met een concentratie van 118 mg / ml aan elk monster.
- Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 300 ronden / min.
- Dialyze de DF-en PP-monsters drie keer tegen de 2 liter van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 gedurende enkele uren per stuk. Voer alle stappen dialyseren bij 4 ° C.
- Centrifugeer het monster 10 minuten bij 14.000 xg en verzamel de bovenstaande vloeistof met DF of PP geconjugeerd aan HSA.
- Controleer supernatant voor eiwitten door het uitvoeren van een SDS-PAGE, met behulp van 12% gels. Belasting ongeveer 12 ug van HSA conjugaat in een gel-sleuf.
2. Bepaal koppeling snelheid van drugs conjugaten (figuur 2)
- Voor de analyse van de koppeling snelheid van DF en PP-conjugaten door HPSEC gebruik maken van een 100 mM natriumfosfaat buffer, pH 6,5 met 150 mM NaCl en 0,05% natriumazide. Gebruik een 7,8 x 300 mm TSK-Gel-G2000 SWXL kolom.
- Voer detectie van signalen met behulp van een online-gekoppelde RI-en UV-detector systeem.
- Bereid een HSA standaard monster met een concentratie van 1 mg / ml in dH 2 O. Voor de detector kalibratie injecteren 50 ul HSA standaardoplossing.
- Bereken de constante k RI RI en de UV-k UV voor de detector. Gebruik de formules gebied RI = k RI * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] en het gebied UV = UV-k * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] met (dn / dc) HSA = 0.185 en (dA / dc) HSA = 0,518 5.
- Bereid DF en PP afgeleide normen voor HPSEC die 5, 10 en 30 nmol hoeveelheden van beide normen kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd.
- Bereken gemiddelde waarden voor (dn / dc) drugs-en (dA / dc) drug voor beide standaarden. Voor DF, een (dn / dc) van 0,235 ± 0,010 en een (dA / dc) van 39,000 ± 0,493 werd bepaald. Voor PP, een (dn / dc) van 0,328 ± 0,016 en een (dA / dc) van 53,155 ± 2,464 werd bepaald.
- Injecteren geneesmiddel conjugaten op HPSEC en bepalen hun RI en UV piekoppervlakken.
- Bereken de concentratie van DF, PP derivaat, en HSA door het oplossen van de twee vergelijkingen gebied RI = k RI * [(dn / dc) drug * c (drug) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] en het gebied UV = k UV * [(dA / dc) drug * c (drug) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] voor de onbekenden.
3. BBT met behulp van drugs conjugaten
- Bereid zeven flowcytometrie flacons en label ze afhankelijk van hun inhoud: onbesmet controle, negatieve controle, positieve controle, en drugs conjugaten.
- Pipetteer 50 ul van de B-CCR-STB stimulatie buffer (flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) in de flesjes gereserveerd voor de ongekleurd en negatieve controle. Als een positieve controle, het gebruik 50 ui van een anti-FcεRI oplossing van de flow2 CAST kit. Voeg de juiste hoeveelheid conjugaat oplossing om de flesjes gereserveerd voor de drug conjugaten door het creëren van een 1:10 verdunning serie van 0,02 -20 ug / ml DF conjugaat en PP-conjugaat (eindconcentraties in een assay volume van 200 pi). Deze titratie-experimenten moeten worden uitgevoerd om de concentratie van optimale basofielen activatie voor elke patiënt monster te bepalen.
- Voeg 100 ul buffer stimulatie aan elke buis en 50 ul patiënt EDTA volbloed. Meng de monsters.
- Pipetteer 20 ul flow2 CAST vlekken reagens met anti-CCR3 antilichamen die zijn gemerkt met phycoerythrine (PE) en anti-CD63 antilichamen die zijn gemerkt met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) aan elke buis en meng opnieuw. Niet pipet vlekken reagens in de ongekleurd monster!
- Incubeer de monsters gedurende 45 minuten in een 37 ° C waterbad.
- Stop reactie op ijs gedurende 5 minuten.
- Lyse erytrocyten door het toevoegen van 2,0 ml flow2 CAST lyserend reagens aan elke flacon en vortex voorzichtig. Incubeer monsters in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifuge monsters voor 5 minuten bij 500 xg en decanteer zorgvuldig supernatant.
- Resuspendeer cellen in 500 pi flow2 CAST wasbuffer en op te slaan op het ijs tot flowcytometrie.
- Stel de flowcytometer het voltage snstellingen voor vooruit en zijwaartse verstrooiing (FSC, SSC), terwijl het verwerven van de ongekleurd monster.
- De poort van de cellen voorspeld als lymfocyten uit het SSC-FSC-complot om de SSC-PE-plot. Basofielen zijn te herkennen aan een PE-gelabeld anti-antilichaam CCR3 als CCR3 hi SSC lo en gate ze in de FITC-PE plot. De anti-CD63 antilichaam detectie geactiveerd basofielen is gelabeld met FITC.
- Stel de cut-off tot maximaal 2,5% van de basofielen als CD63 hi in de negatieve controle. Een monster wordt als positief voor basofielen activatie indien> 5% basofielen zijn CD63 hi en de gemiddelde fluorescentie-index (MFI) van het monster gedeeld door de MFI van de negatieve controle groter is dan 2 (Figuur 3).
4. Representatieve resultaten:
Dit experiment evalueert BBT als een heilzaam middel om IgE-afhankelijke overgevoeligheid voor geneesmiddelen op te sporen. Eiwit conjugaten van NSAID's worden gebruikt voor de activering van basofielen. Door HPSEC met RI-en UV-detectie aggregatie toestand, koppeling graad, en de effectieve rendement van de conjugaten worden bepaald. Zoals figuur 4 laat zien, 43,5% van de DF conjugaten bleef monomeer met een koppeling mate van 5.0 DF / HSA. Voor de aggregaten een koppeling graad van 9,5 werd vastgesteld. De propyphenazone conjugaat bleek te bestaan uit 68,5% monomeren met een koppeling graad van 21,2. De koppeling mate van de aggregaten was 27,9. In totaal heeft de vastgestelde koppeling mate van DF conjugaten was 7,6 DF en die van PP conjugaten was 23,2.
BAT uitgevoerd met conjugaten onder optimale omstandigheden (concentratie van conjugaten, stimulatie tijd) mag het onderzoek van IgE-afhankelijke reacties in NSAID overgevoeligheid. Zoals weergegeven in figuur 5, alleen de PP conjugaat kon veroorzaken basofielen activatie gevisualiseerd door een opregulatie in CD63 oppervlakte expressie: 20,6% van de basofielen werden geactiveerd gekenmerkt door een log-verschuiving in de fluorescentie-intensiteit. De MFI verhoogd met een factor van 4,9 van de 386 (negatieve controle) naar 1893. In tegenstelling, het gebruik van de DF conjugaat slechts 3,1% van de basofielen werden geactiveerd die lager was dan de 5% cut-off. Ook de MFI nam slechts met een factor 1,1 (limiet 2,0) van 197 (negatieve controle) tot 210. Test validiteit wordt gegeven door (i) <5% basofielen activatie in de negatieve controle, (ii) een log-verschuiving in de fluorescentie-intensiteit van een basofiele subpopulatie, en (iii)> 50% geactiveerde basofielen (positieve controle).
Figuur 1. Koppeling van DF en PP-afgeleide aan HSA. Na de ontbinding van de drugs, water, MES buffer, en EDC (koppeling reagens) worden toegevoegd. De monsters zijn gevortexed gedurende 1 minuut voordat HSA is gepipetteerd om het geneesmiddel oplossingen. Binnen de 2 uur schudden bij kamertemperatuur de drugs covalent binden aan HSA. Monomeren en aggregaten kan veroorzaken.
Figuur 2. Berekening van de koppeling graden. Eerst worden de constanten k RI en k UV bepaald. Daarom wordt HSA standaard met een bekende concentratie geïnjecteerd in het HPSEC systeem. (Dn / dc) en (dA / dc) van HSA worden gegeven waarden van 0,185 en 0,518, respectievelijk 5. De piek gebieden zijn gebruikt voor het berekenen van de constanten. Ten tweede, voor elk geneesmiddel drie normen zijn geïnjecteerd met drug-en concentratie-specifieke RI en UV-gebieden te bepalen. Omdat de k RI en k UV-constanten zijn bekend uit de bovenstaande stappen, kan de drug-specifieke (dn / dc) en (dA / dc) derivaten worden berekend. Ten derde, drug-HSA conjugaten worden geïnjecteerd in HPSEC. De resulterende piekoppervlakken worden gebruikt om de concentraties van het geneesmiddel en HSA per piek te berekenen door het oplossen van de twee vergelijkingen met twee onbekende variabelen.
Figuur 3. Basofiele gating. Cellen voorspeld als lymfocyten zijn gated zijwaartse verstrooiing versus voorwaartse verstrooiing (SSC-FSC plot). De basofielen zijn geïdentificeerd als CCR3 hi SSC lo van de gated lymfocyten (SSC-CCR3-PE plot). Basofielen worden geanalyseerd voor de activering (CD63 hi) in de CD63-FITC-CCR3-PE plot. De negatieve controle wordt gebruikt om de cut-off van maximaal 2,5% basofielen resterende CD63 hi in te stellen.
Figuur 4. Vastberaden koppeling graden van drugs conjugaten. RI-en UV-signalen tonen twee pieken van aggregaten (eluerend bij lage retentie volume) en monomeren (elueren met een hoog retentie volume) van het geneesmiddel-HSA conjugaten. Percentages van monomeren en aggregaten (bepaald op basis van RI-signalen) en hun koppeling graden zijn afgebeeld (n = 1).
Figuur 5. Basofiele activatiop de test. Resultaten van het geneesmiddel conjugaat-geactiveerde monsters, negatieve controles, en positieve controles worden getoond in CD63-FITC-CCR3-PE percelen (n = 1).
Discussion
BAT is een gevestigde, hoewel nog niet routinematig gebruikte methode voor de diagnose van IgE-gemedieerde allergische aandoeningen 6,7. Voor drugs-overgevoeligheid, echter, is de toepasbaarheid gecompromitteerd zo laag moleculair gewicht verbindingen zijn niet in staat om verknopen IgE-receptoren, een voorwaarde voor basofielen activatie 8. Daarom drugs in onderzoek moeten covalent worden gekoppeld aan geschikte drager eiwitten (bijv. HSA). Belangrijk is dat de koppeling graad (dwz het aantal geneesmiddelmoleculen per drager-eiwit) moet worden gecontroleerd om immunologische activiteit te garanderen (dat wil zeggen IgE-receptor cross-linking) van conjugaten. Theoretisch moeten twee haptenen per dragermolecuul voldoende zijn voor de IgE-receptor cross-linking en zo weinig als vijf DF moleculen per HSA is aangetoond dat ze mediator vrij trekker in een cel-gebaseerde test 4. Beide conjugaten, PP-HSA en DF-HSA, zijn vastbesloten om een voldoende hoge graad koppeling (HPSEC) weer te geven en om immunologisch actieve waardoor ze geschikte reagentia voor gebruik in de BBT. Een ander probleem kan zijn dat drug metabolieten een rol kan spelen, als een metaboliet in plaats van de ouder geneesmiddel kan de overgevoeligheidsreactie veroorzaken. In het geval van DF, is deze mogelijkheid is geëvalueerd in detail voorheen met behulp van vijf belangrijke fase I-metabolieten en een koppeling variant 4. Belangrijke factoren voor het beheersen van de beschreven techniek onder meer de kwaliteit van het bloedmonster (<12 uur sinds bloedafname, het aantal gedetecteerde basofielen> 500) en optimalisatie van de stimulatie omstandigheden (tijd, dosis). Daarnaast, de zogenaamde non-responders die niet eens reageren met de positieve controle (antilichaam, gericht tegen de IgE receptor) moeten worden geïdentificeerd. Daarom validatie criteria moeten een anti-FcεRI antilichaam als positieve controle bevatten. Een belangrijk voordeel van het gebruik van drugs conjugaten is het feit dat ze lijken niet giftig, in tegenstelling tot pure drugs, zoals te zien voor DF-HSA conjugaat door co-stimulatie met anti-FcεRI antilichaam in BAT 4. Zuivere DF, in tegenstelling, displays cytotoxische effecten bij een concentratie van 1,25 mg / ml veroorzaakt problemen met de interpreteerbaarheid van BBT 9. Over het algemeen is het testen op potentiële cytotoxiciteit sterk aanbevolen voor iedere nieuw geproduceerde drug conjugaat.
Hier hebben we aangetoond dat het potentieel van de PP-HSA-conjugaat die gebruikt in de BAT om IgE-gemedieerde overgevoeligheid onthullen. In tegenstelling, is DF overgevoeligheid niet geassocieerd met IgE aangetoond door het ontbreken van basophil activering in reactie op de DF-HSA conjugaat. Belangrijk is dat in geval van onzekerheid over een IgE-gemedieerde mechanisme conjugaten moeten worden geëvalueerd voor immunologische activiteit door in vitro cel-gebaseerde test systemen zoals is aangetoond voor DF 4.
Met behulp van de beschreven opzet van het vervoegen van laag moleculair gewicht drugs covalent aan geschikte eiwit dragermoleculen een aantal overgevoeligheidsreacties tegen geneesmiddelen, waaronder antibiotica, andere NSAID's, radiocontrast media, spierverslappers, anesthetica, kan enz. worden onderzocht voor een betrokkenheid van een IgE-gemedieerde mechanisme. Daarom kunnen de BBT dienen als een aanvulling op de bestaande methoden voor de diagnose (huidtest, mondelinge provocatie testen).
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Oostenrijkse Science Fonds (FWF) subsidie P18820-B13.
Ethiek statement:
De studie werd goedgekeurd (PLUS_Ethik_090514) door de ethische commissie voor de experimenten met mensen en / of dieren aan de Universiteit van Salzburg te voldoen aan de Helsinki Declaraction als herzien in 1983 en alle patiënten die deelnamen gaven hun schriftelijke informed consent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3671 | - |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Corp. | 08540 | - |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | 338962 | - |
| Bench top centrifuge | Sigma-Aldrich | - | - |
| Diclofenac sodium salt | Sigma-Aldrich | D6899 | - |
| EDTA-Vacutainer | BD Biosciences | 368589 | - |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett-Packard | - | - |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | - |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | - | - |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | E6383 | - |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | - |
| Propyphenazone derivative | University of Salzburg | - | - |
| Shaker | Eppendorf | - | - |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S1679 | - |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | 90421C | - |
| Sodium hydroxid | Sigma-Aldrich | S5881 | - |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | - |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | - |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | - |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | - |
References
- Himly, M. IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone. J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).
- Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity. Allergy. 63, 616-619 (2008).
- Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).
- Harrer, A. Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites. PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).
- De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).
- Ebo, D. G. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61, 1028-1039 (2006).
- Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils. Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).
- Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).
