분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의 시험관 심장 비대

심근 증식하지 않습니다. HL-1 및 마우스 심방 종양 유래 AT-1 세포와 같은 일부 심방 심근 세포주가있다; 그러나, 연구에는 성인 심실 심근 세포주가 없다. 성인 마우스 심근의 기본 세포 배양은 세포 및 분자 수준에서 심장 연구를위한 강력한 모델을 제공합니다. 지금까지, 그들은 생화학 생리 및 약리학 적 연구 ^1에 광범위하게 사용되어왔다. 또한, 유전자 변형 생쥐의 빈번한 사용은 심근 분리의 효과적인 방법을 필요하게되었다. 순수 배양은 다른 기관과의 상호 작용이없는 상태와 같은 내인성 신경 호르몬 및 호르몬과 같은 요인에 ^2,3를 통해 같은 전신 순환 할 수 있습니다. 그러나 심근을 성공적으로 격리 도전하실 수 있습니다.

우리가 여기에서 소개하는 프로토콜은 성인 쥐 cardiomyocyt와 우리의 경험을 기반으로합니다에스 오코넬 등 ^4,5에서 설명하는 방법. 특히 2007 ^5, 그들은 세포 배양 및 기능 분석에 버퍼 준비에서 자세한 방법을 설명했다. 마우스의 근육 세포가 쥐의 심근에 비해 구축에 매우 민감하기 때문에, 마우스 프로토콜의 관류, 소화, 칼슘 ^{2 +} 관용, 도금 및 문화에 사용되는 버퍼 나 미디어는 비특이적 여기 수축 커플 링 억제제, 2 보충된다 자신의 자발적인 수축을 억제하는 3 - 부탄의 monoxime (BDM)가, 따라서 생존과 막대 모양의 근육 세포의 수율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 여기에 소개 된 프로토콜에서 근육 세포는 타입 II 콜라와 수정 랑겐 재관류에 의해 고립 된 마음에서 고 칼륨 버퍼에 구분됩니다. 콜라게나 II 효과적으로 간 매트릭스 해제 세포를 분해. 관류 솔루션은 낮은 레벨 ^6에서 세포의 신진 대사를 유지합니다. 책상 외에도에서에, 우리는 여기에 사용 된 하버드 장치에서 분리 된 심장 시스템은 정확한 온도와 일정한 압력 제어 ⁷ 잘 설계되어 있습니다. 이러한 접근법은 높은 재현성 제제 및 심장 비대 분석법위한 신호 단백질 또는 2~3일 배양을 측정 밤새 배양에 사용할 수있는 단일 셀 타입의 균일 한 집단을 제공한다.

마우스의 모든 연구는 절차와 건강의 국립 연구소의 가이드 라인에 따라 수행하고, 프로토콜은 톨레도 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회, 의학 및 생명 과학 대학에 의해 승인되었습니다.

1. 관류 시스템 준비

1. 격리 전날, 빠른 알칼리 잔류 물이없는 세제와 (저수지 포함) 전체를 관류 시스템을 입력합니다. 이 솔루션은 몇 시간 또는 밤새 시스템에 흡수 할 수 있습니다.
2. 다음 날 아침, 37 ° C의 열 순환기 온도를 조정하고 솔루션을 따뜻하게 할 수 있습니다. 세제 액을 제거하고 멸균 증류수로 철저히 시스템을 세척하십시오. 모든 측면 가지를 잊지 말라.
3. 일정한 연동 펌프를 통해 관류 버퍼 시스템을 입력하고 모든 공기 보호 측면에 장착 된 주사기와 대동맥 챔버 (버블 트랩)으로부터 거품 그리기관상 동맥 폐색의 마음. 연동 펌프의 유량은 정기적으로 점검해야한다.

2. 버퍼의 준비, 문화, 미디어 및 요리

1. 관류 버퍼 : 1X 관류 버퍼 500 ㎖ 사용하기 전에 확인합니다. 이 칼슘 무료 버퍼는 113 mM의 NaCl을 4.7 밀리미터의 KCl, 0.6 mM의 KH ₂ PO _4, 0.6 ㎜ 나 ₂ HPO _4, 1.2 ㎜ _망초, 10 mM의 NA-HEPES, 12 mM의 _탄산 수소 나트륨, 10 mM의 KHCO _3를 포함 0.032 빨간색 mM의 페놀, 30 mM의 타우린, 10 mM의 BDM, 5.5 mM의 포도당. 2 M 염산으로 7.0으로 산도를 조정하고 4 ℃에서 0.2 μm의 필터, 매장을 통해 필터링
   주 :이 사용될 때) 관류 용액 당일에 준비되어야한다. 경우에 따라서는 4 ° C. 미만 3 일간 용액을 저장하는 수용 B)이 버퍼는 ATP의 C에게 감소, 대기 심근을 유지할 수 있습니다 15.3 mm로 높은 칼륨 농도를 위로,가onsumption 및 CA ^{2 +} 허용 능력을 향상시킬 수 있습니다.
2. 소화 버퍼 (300 U / ㎖, 25 ~ 50 ㎖ / 마음) : 직전 관류에 준비합니다. 문화 후드에서 50 ㎖ 관류 버퍼에 용해, 유형 II 콜라게나 제의 전체 활동의 15,000 U 무게. 최종 칼슘 농도 50 μM을 만들기 위해 100 ㎜ _{염화칼슘의} 25 μL (살균 원액, 필터)를 추가합니다. 분리를위한 준비 37 ° C의 버퍼를 따뜻하게. 트립신과는 달리, 콜라게나 제는 50 ~ 100 μm의 칼슘 ^{2 +의} 존재에 가장 잘 작동합니다.
3. 정지 버퍼 (50 ㎖ / 하트) : 문화 후드에서 작동합니다. 5 ㎖ 멸균 FBS와 관류 버퍼 45 ㎖를 혼합.
   1. 칼슘 ^{2 +} 솔루션은 I (12.5 μM 칼슘 ^{2 +)} : 정지 버퍼 20 ㎖에 100 ㎜ _염화칼슘 2.5 μl를 추가하고 혼합한다.
   2. 칼슘 ^{2 +} 솔루션 II (100 μM 칼슘 ^{2 +)} : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ _{염화칼슘의} 10 μl를 추가하고 혼합한다.
   3. 칼슘 ^{2 +} 솔루션 III (400 μM 칼슘 ^{2 +}) : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ _{염화칼슘의} 40 μl를 추가하고 혼합한다.
   4. 칼슘 ^{2 +} 솔루션 IV (900 μM 칼슘 ^{2 +)} : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ _{염화칼슘의} 90 μl를 추가하고 혼합한다.
4. 전송 문화 후드에서 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 2 밀리미터 L-글루타민과 1.26 mM의 _{염화칼슘을} 포함하고 FBS 5 ㎖를 추가 MEM 43 ㎖, BDM 원액 1 ㎖ (: (50 ㎖ / 하트) 매체를 도금 500 mm의 필터 살균), 0.5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10,000 U / ㎖). 혼합 2 %의 CO _2, 느슨한 모자와 37 ° C 배양기에서 이전의 심근 세포 분리에 2 ~ 3 시간 동안 평형. 오른쪽 심근 도금 전에 배지로 200 mM의 ATP 0.5 ㎖ (pH를 7.2, 스톡 용액, 멸균 필터)를 추가한다.
5. 문화 매체 (50 ㎖ / 하트) : 이전 48 문화 후드에서 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 2 밀리미터 L-글루타민과 1.26 mM의 _{염화칼슘을} 포함하는 MEM ㎖ 및 BDM 원액 (500 mm의 1 ㎖, filte를 추가r)로 멸균하고, 0.5 ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10000 U / ㎖). 혼합 2 % CO _2, 37 ° C 배양기 이전에 심근 세포 분리에 평형. 사용 전에 배지에 100 ㎎ / ㎖ BSA 0.5 ㎖ (멸균 필터)를 추가한다.
   참고 : 2 % CO ₂ 배양기를 사용하여 myoctyes은 24 시간까지 자신의 막대 모양의 형태를 유지하는 데 도움이 6.9-7.0의 배양액의 pH를 유지 용이하게한다.
6. 라미닌 (1-2 ㎍ / cm ²⁾ 코팅 요리 또는 플레이트 : 멸균 PBS (w / 칼슘과 마그네슘 O) 20 ㎖를 혼합로 전송 / ㎖ 자연 마우스 라미닌 1 mg을 200 μl를. 100-mm 요리에 35-mm 요리, 60-mm 요리에 2.5 ㎖, 또는 5 ㎖에 1 ML을 추가 균일하게 표면을 커버하는 악수, 장소 CO ₂ 2 %에서, 37 ° C 배양기 심근 도금까지.
   참고 : 요리 나 플레이트가 코팅 된 날에 사용하지 않으면, 그들은 파라 필름으로 밀봉하고 4 ° C 하룻밤 (느린 코팅)에 저장할 수 있습니다. 씰링 requ에있다IRED 증발 및 오염을 방지한다. 코팅 된 플레이트는 최대 1 주일 동안 4 ° C에 보관하실 수 있습니다.

3. 마우스 심장 제거 및 삽관

1. 30 분 동안 70 % 에탄올에 가위와 집게를 만끽하고 건조 할 수 있습니다.
2. 가장 가까운 0.1 그램으로 마우스의 무게를. 몸 무게, 변형, 성별, 생년월일을 기록합니다.
3. 200 ㎕의 헤파린을 주입 (100 IU / 마우스) IP 10 분 이전에 관상 동맥에서 혈액의 응고를 방지하기 위해 마취. 200 케타민 (ketamine) / kg 체중 MG 및 IP 주사 자일 라진 10 ㎎ / ㎏ 체중으로 마우스를 마취하고 마우스 꼬리 / 발가락 핀치에 응답을 중지 할 때까지 5 ~ 10 분 동안 기다립니다.
4. 부드럽게 관류 시스템 근처 동물 수술 트레이 또는 테이블 벤치에 pinnable 작업 표면 (예 : 스티로폼)에 앞발과 hindpaws를 고정하여 누운 위치에 마우스를 고정합니다.
5. 70 % 에탄올로 가슴과 복부를 닦아주십시오. 중간 선 피부 나 만들기수술 가위와 다이어프램 중순 복부 ncision.
6. 다른 수술 가위로 다이어프램을 잘라 곡선 톱니 모양의 집게와 흉골을 누르고 있습니다. 양측 잘라 마음을 노출 가슴 케이지를 retroflect.
7. 미세한 톱니 모양의 곡선과 atraumatic 집게를 사용하여 약간의 마음을 들어 올려 등의 흉부 벽에 최대한 가깝게 흉강 밖으로 마음을 해부하다.
8. 차가운 관류 버퍼를 포함하는 100-mm 요리에 마음을 전송합니다. 조심스럽게 이러한 폐, 흉선, 그리고 기관지 등의 결합 조직을 멀리 트림.
9. 일반적으로 흉선 및 지방 패드에 의해 숨겨진 대동맥과 뇌 지점을 확인합니다. 마음을 들어 올려, 대동맥 벽을 파악, 최초의 지점 ⁽¹³⁾ 아래의 대동맥을 절단하고, 약간 관류 액으로 채워진 대동맥 캐뉼라 (평면 / 무딘 팁과 노치 1 위 2mm 1.0 mm 외경 스테인레스 스틸 캐 뉼러에 맵시 두 초 미세 팁 F를 사용하거나 22 G 재사용 먹이 바늘) 팁orceps.
   주 : a) 관류 유체가 관상 동맥 들어가는 기포를 방지하는 심장 삽관 중에 적하한다; B) 바로 대동맥 판막 이상으로 정맥의 끝을 유지합니다.
10. 정맥에 대동맥 클램프와 6-0 수술 실크 정맥에 대동맥 결찰. 전체 삽관은 120 초 이하로해야한다.

4. 심장 관류 및 소화

1. 4 ML의 유속으로 칼슘이없는 관류 버퍼 마음을 Perfuse / 분 약 4 ~ 5 분 폐수가 명확해질 때까지, 다음 50 μm의 _{염화칼슘을} 포함하는 소화 버퍼로 전환 마우스의 변형에 따라 3.5-20 분 동안 perfuse, 관류 압 및 콜라게나 제 활성. 해당되는 경우 소화 할 때, 70 ~ 80 mmHg로 대동맥 압력을 증가시킨다. 필요한 경우, 효소 관류 소화를 위해 재순환 될 수있다. 전형적으로, 300 U / ml의 효소 버퍼 ㎖ / 분 (4)의 유속으로 10-12 분에서 심장을 소화 할 것이다;70 mmHg로 후 부하에 압력을인가하는 경우, 300 U / ml를 4 ml / 분의 유속으로 만 3.5-5.5 분 걸릴 것이다.
2. 마음이 약간 창백하고 이완 될 때 소화를 중지합니다. 부드럽게 끼 때 스폰지해야한다.

오. 세포 해리 칼슘 재 도입

1. 70 % 에탄올을 묻힌 집게와 정맥에서 대동맥을 당겨 2.5 ml의 소화 버퍼를 포함하는 멸균 60 mm 접시에 담아. 이 멸균 기술을 염두에 머물고 및 후속 단계 살균 용품을 사용하여 문화 후드로 이동합니다.
2. 미세 수술 가위로 대동맥, 심방과 큰 혈관을 제거합니다. 조심스럽게 두 미세 팁 집게로 10-12 작은 조각으로 심실을 애타게.
3. 조심스럽게 10 ML 전송 피펫으로 심장 조각 셀 위로 ~ 10 배 아래로 피펫 후 15 ㎖의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. I는 12.5 μM _염화칼슘 및 전송을 포함하는 7.5 ㎖의 칼슘 용액으로 요리를 씻어이 튜브에, 10 ㎖의 최종 부피의 결과.
4. 살짝 위로 심장 조직의 큰 조각을 분산하기 위해 미세 팁 전송 피펫을 사용하여 아래로 세포 현탁액을 피펫.
5. 다음과 같은 내피 세포와 섬유 아세포와 같은 작은 비 심근 세포를 분리하기 위해 20 XG에서 3 분 동안 원심 분리.
6. 뜨는 대기음 및 10 ㎖의 칼슘 용액에 심근 세포 펠렛을 재현 탁 200 mM의 ATP 100 μL (산도 7.2, 원액, 살균 필터)의 보충과 I. 3 ~ 5 분 동안 후드에 튜브를 남겨주세요.
7. 전송 막대 모양의 둥근 근육 세포를 계산하는 hemacytometer에 10 μL 씩 분주 중복. 심근 세포의 총 수를 계산하고 봉상 심근 세포의 비율을 계산한다.
8. 20 X g에서 3 분의 근육 세포를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 100 μM _{염화칼슘을} 포함하는 10 ㎖의 칼슘 솔루션 II의 펠렛을 재현 탁. 피펫 팅에 의해 미세 팁 전송 피펫과 근육 세포를 분산상하.
9. 각각 칼슘 용액 III (400 μM _{염화칼슘)와} IV (900 μM _{염화칼슘)를} 사용하여 상기 단계 (5.8)를 반복합니다.
10. 쥐 심근 일차 배양을 위해, 배지를 도금 5ml에 심근 최종 펠렛을 재현 탁. 심근 세포의 총 수를 계산 및 막대 형상 심근 세포의 비율을 계산한다.

6. 세포 배양

1. 50 ㎖의 튜브에서 25,000 봉상 심근 세포 / ㎖로 막대 모양의 심근 세포의 농도를 조정. 부드럽게 잘을 일시 중지 10 ML의 피펫을 사용하여 근육 세포를 피펫. 각 접시 또는 플레이트 같은 세포의 밀도를 보장하기 위해 피펫 및 튜브에 세포의 침전을 피하십시오.
2. 라미닌의 코팅 용액을 흡입 한 후, 그 그릇이나 접시에 근육 세포를 접시. 조심스럽게 문화 후드의 표면에 접시 또는 플레이트 전후 및 좌우 크로스와 같은 패턴 3 4 시간을 밀어 넣습니다.
3. 2 %의 CO에서 요리 나 플레이트를 배치37 ℃에서 ₂ 배양기 약 80 %의 비율로 심근 세포의 부착을 허용하는 1-3 시간 동안 배양한다.
4. 부착 후, 온화 무소속 근세포 및 세포 파편을 포함하는 매체를 대기음. 부드럽게 요리 나 플레이트의 측면에 배지를 추가합니다. 하나이 매체 변경을 수행합니다. 즉시 인큐베이터에 요리 또는 번호판을 반환합니다.
5. O / N 배양 후, 근세포 ​​단기간 세포 신호의 연구 전에 BDM없이 동일 매체에 변경할 수있다. 비대 또는 세포 사멸 분석을위한 장기 문화 BDM을 유지합니다.
   참고 : BDM (2,3 - 부탄 디온 monoxime)는 마이 오신 ATPase의 활성도를 억제하고 수축을 방지 할 수 있습니다. 마이 오신 기반 수축의 억제는 쉽게 뒤집을 수있다. 그것은 BDM는, 비특이적 포스파타제 역할 SR로부터의 칼슘 방출을 증가시키고 자유 칼슘 농도 및 셀룰러 전기 prope의 변질 등의 일부 잠재적 인 부작용을 가질 수 있다는 것을보고rties 때문에 치료 전, BDM은 제거되어야한다. 더욱이, 어떤 경우에는, 특정 미오신 II 억제제 Blebbistatin은 심근 ^수축을 억제하는 ^8,9 대체 약물이 될 수있다. 그러나, 우리의 경우에, BDM은 심근의 질과 양을 위해서 Blebbistatin보다 낫다.

1. 성공적인 분리 정량

두 가지 기준은 절연 성공을 정량화하기 위해 사용된다 : 첫째, 전체 절연 심장 근세포의 개수, 및 제, 봉상 칼슘 내성 반올림 비 내성 근세포의 비율. 일반적으로이 프로토콜은 심장 제거에서 심근 도금 한 성인 마우스 마음에서 수율 약 1 백만 막대 모양의 심근 (수확 전체 근육 세포 70 ~ 90 %)을 주위에 75 ~ 90 분입니다. 이 기능은 마우스의 체중과 변형에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 0.7 ~ 1.0 백만 막대 모양의 근육 세포는 ~ 25g의 C57BL/6J 마우스, ~ 35g으로 블랙 스위스 마우스에서 1.2-1600000 막대 모양의 근육 세포 및 0.7-1200000 막대 모양의 근육 세포에서 수집 할 수 있습니다 ~ 30g 나 / K-ATPase의의 이형 (α1의 S / R) 10 ~ 22g 심장 특정 NCX-KO 마우스 (11)로부터 수집. 고립 된 근육 세포는 일반적으로 직사각형 끝 명확한 교차 줄무늬가있는 별개의 막대 모양이그림 1.

2. 세포의 기능 식별

우리의 이전 데이터는 명확하게 배양 신생아 쥐의 심근에, 100 μM의 ouabain는 PI 3에게 K-종속 된 Akt의 인산화를 활성화하고 비대 (12)을 유도 할 수있는 것으로 나타났습니다. 더욱 성숙한 쥐 심장 근세포에서 이러한 결과를 확인하기 위하여, 성숙한 C57BL/6J 마우스 심장 근세포를 배양하고 ouabain 처리 하였다. 2 및 3 깨끗이 ouabain이 용량 의존적으로 Akt 포스 포 릴레이션을 증가 [3 H] - 류신을 유도 할 수 있음을 보여준다 단백질 합성시.

그림 1. 블랙 스위스 마우스에서 일반 막대 모양의 심근 하룻밤 후문화. 근육 세포는 사진 소프트웨어를 사용하여 위상차 현미경에서 촬영되었다.

배양 성인 C57BL/6J 마우스의 심근에 ouabain에 의한 Akt의 그림 2. 정품 인증. 심근 세포는 5 분 ~ 50 μM의 ouabain에 노출되고, 해물은 서양에 의해 인산화 (SER 473)의 Akt (P-Akt의)과의 Akt에 대해 분석 하였다 오. 정품 인증은 총 Akt의 인산화의 비율 (N = 5-10)로 정량 하였다. * P <0.05 제어 대, ** P <제어 대 0.01.

그림 3. Ouabai., n은 4 시간의 혈청 부족하면 근육 세포가 함께있는 ouabain 또는 100 nm의 ET-1 (양성 대조군)의 존재 또는 부재 [3 H]에서 발생한 상황을 처리 하였다 배양 성인 C57BL/6J 마우스의 심근에서 단백질 합성을 자극 - 12 시간 동안 로이신 (1 μCi / ㎖). 세포 용 해물을 5 % TCA로 침전 및 0.2 M NaOH/0.1 % SDS에 재현 탁하고, 방사능은 섬광 계수기에서 계수 하였다 하였다. 샘플 당 단백질 합성 / mg의 단백질 및 제어에 비해 정규화 CPM을 계산되었다.

성인 마우스 심근 격리를위한 표 1. 솔루션 / 버퍼.

표 2. 성인 마우스 심근의 분리 및 배양 원액 준비 및 저장.

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.