β-catenin의 저하의 재구성 Xenopus의 계란 추출

는 Xenopus laevis의 계란 추출물은 세포 골격 역학, 핵 조립 및 수입, 세포 사멸, 유비퀴틴 대사, 세포주기의 진행, 신호 전달, 단백질 회전율 ^1-17를 포함하여 많은 세포 생물 학적 과정을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 계란 추출물은 본질적으로 이러한 프로세스를 실행하고 조사를 활성화하는 데 필요한 모든 필수 세포질 구성 요소가 포함되어 희석 세포질을 나타 내기 때문에 Xenopus의 계란 추출물 시스템은 세포 프로세스의 군단의 생화학 적 분석에 대한 의무입니다. 계란 추출물 많은 양의 물질 ​​(예, 단백질 정제 또는 고 처리량 스크리닝) ^18-20의 많은 양을 필요로 생화학 적 조작에 대해 한 번에 제조 할 수있다. 또 다른 장점은 Xenopus의 계란 추출물에서 특정 단백질의 농도가 정확하게 재조합 단백질 및 / 또는 endog immunodepletion의 첨가에 의해 조절 될 수 있다는 것이다또한 단백질의 발현을 제어하기 어렵다 플라스미드 DNA의 형질 대조적 enous 단백질. 또, 사용 가능한 재조합 단백질의 결여는 외생 첨가 mRNA의 번역을 위해 새로 제조 Xenopus의 계란 추출물의 고용량을 활용 관심 단백질을 코딩하는 전 사체의 첨가에 의해 극복 될 수있다.

단백질 분해의 규제는 많은 세포 경로의 조절에 중요합니다 ^21. Xenopus의 계란 추출물이 시스템은 전사와 번역의 혼란의 영향없이 단백질 회전율을 모니터링 할 수있는 여러 가지 방법에 대해 허용하는 단백질 분해를 연구하기 위해 광범위하게 사용되어왔다을 처리합니다. Wnt 신호 전달 경로 개발과 질병에 중요한 역할을 담당하고 매우 보존 신호 통로입니다. β-카테닌,이 Wnt 경로의 주요한 효과기의 회전율은 매우 증가 된 정상 상태 L에게 규제되고,β-catenin이의 거시기는이 Wnt 표적 유전자의 활성화를 위해 중요합니다. β-catenin의 분해의 중요성은 β-catenin의 분해를 억제로 Wnt 경로에 돌연변이가 ~ 대장 암 ^(22)의 모든 산발적 인 케이스의 90 %에서 발견되는 사실에 의해 강조 표시됩니다. 이 Wnt 경로의 구성 요소에 의한 β-catenin의 저하가 충실히 매출의 메커니즘을 연구 할뿐만 아니라 분해 ^{2, 19, 20, 23 ~ 29의} 새로운 작은 분자 변조기를 식별하는 Xenopus의 계란 추출물에 효과적으로 요약 할 수있다.

세포주기를 공부 Xenopus의 계란 추출물의 제조 방법은 이전 조브 공보 ^30-32에 기술되었다. 현재 프로토콜은 이러한 방법의 변형을 설명하고의 분해에 최적화되어 있습니다 ^[35 S] - 방사성 표지 된 β-catenin의와 루시 페라 제 - 태그 β-catenin이있는Xenopus의 계란 추출물. 방사성 동위 원소 분해 분석은 오토 라디오를 통해 단백질 수준을 직접 시각화 할 수 있습니다. ^[35 S] 메티오닌이어서 직접 분해 반응에 첨가 될 수있는 시험 관내 번역 반응을 사용하여 관심의 단백질에 도입된다. 또한, 방사성 표지 단백질 회전율 분석은 단백질 안정성에 영향을 미칠 수있는 그 단백질 또는 에피토프 태그에 대한 항체를 요구하지 않는다. 단백질 수준에서도 작은 변화, 방사성 표지 된 단백질 밴드의 강도의 변화에 반영 용이 오토 라디오 그래피에 의해 시각되므로 ^[35 S]를-방사성 표지 분해 분석은 단백질 ^회전율이 시각화를위한 매우 유용한 방법을 나타낸다.

순서 반딧불 루시페라아제에 β-카테닌의 퓨전 (이하, 간단히 「루시퍼 "라 함), 단백질 수준의 정밀하고 손쉬운 정량적 측정을 허용β-catenin의 회전율 ^{19, 20의} 운동 특성을 결정합니다. 루시퍼 라제 분석의 주요 장점은 쉽게 확장되어 강한 양적 시스템을 제공한다는 것이다. 다음 프로토콜은 β-catenin의 분해 및 신규 β-catenin의 변조기의 높은 처리량 검사를위한 강력하고 효율적이며 효과적인 방법을 시금위한 간단한 방법을 제공합니다.

Xenopus의 계란 추출물 1. 준비

참고 : 각 개구리 사용할 계란 추출물의 약 1 ㎖를 얻을 수 있습니다. 10 개구리의 추출물을 통상 한번에 제조하고, 후술 버퍼의 부피는 10 개구리 Xenopus의 계란 추출물 준비를 행하는이다된다. 버퍼 볼륨은 계란 추출물의 크거나 작은 제제에 따라 조정될 수있다. 이런 방법으로 준비합니다 일관 단백질 농도보기 ≥ 50 ㎎ / ㎖를 얻었다. 이명 실시한 경우 계란을 수집하고 엑기스로 그들을 처리 과정은 가장 효율적이다. (기본 개구리 사육 기술의 경우, 시브 등. ^{33 참조).}

1. 계란 컬렉션
   1. 프라임 개구리, 갓 만든 250 U / ㎖ 주식에서 임신 마레 혈청 성선 자극의 100 U (PMSG) 각 여성 개구리를 주입. 의 경사와, 피하 주입하기 위해 27 G 바늘로 3 ㎖의 투베르쿨린 주사기를 사용하여약 1cm 거리에 개구리의 다리의 길이를 따라 톱니 모양의 색소 침착의 중간 선에서의 위치 등의 림프 낭에 바늘까지.
   2. 물에있는 상점 준비하는 개구리 5-10 일 동안 18 ° C에서 (플러스 20 mM의 염화나트륨은 시브 등. ^{33 참조).} 수조 시스템 서 들어, 동물의 밀도는 여성 개구리 당 물 약 4 L이다. 참고 : 적용하려면 프라이밍에 필요한 최소 시간은 5 일이며, 프라이밍 효과는 10 일 이후 깨어나.
   3. 20 배 MMR의 재고 0.5 배 마크의 수정 링거 (MMR) 솔루션을 준비합니다. (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), pH를 7.4 - 20X MMR 2 M 염화 나트륨, 40 mM의 염화칼륨, 40 mM의 염화칼슘, 20mM의​​ 염화 마그네슘, 및 100 mM의 4로 구성된다.
   4. 모든 주입 개구리 (4 L 물통 당 하나의 개구리)에 대한 버킷을 설정합니다. 참고 : 하나 이상의 개구리, 계란 수집 같은 버킷에 배치 할 수 있지만 경우에 개구리 중 하나주로 가난한 품질의 알을 낳는 노력의 상당한 양을 추출하기에 적합 함과는 품질이 계란을 분리해야합니다. 따라서, 알 사용 버퍼의 양을 최소화하기 위해 동일한 탱크 개구리의 개수를 수집 최대화 위험 가치가 없다.
   5. 1.1.1에 설명 된대로 27 G 바늘을 사용하여 각 개구리의 등 림프 낭에 750 U 인간의 태반 성 성선 자극 (HCG)를 주입한다.
   6. 0.5 배의 MMR을 포함하는 개인 4 L의 버킷으로 HCG 주입 개구리의 각을 놓고 16 ℃로 냉각
   7. O / N (15 ~ 16 시간) 계란을 수집하기 위해 16 ° C 배양기에서 개구리와 용기를 놓습니다. 참고 : 적정 온도를 유지하는 것은 계란 추출물을 준비에 계란을 수집하는 전체 절차에 대한 중요합니다.
2. 계란을 Dejellying
   참고 : 계란이 이전 추출물을 만들기 위해 제거해야 젤리 코팅으로 덮여있다. 계란의 자연 용해의 가능성은 시간 betwee로 증가N 달걀 누워 및 준비가 증가 압축을 풉니 다. 따라서, 가능한 빨리 다음 단계를 진행하는 것이 중요합니다.
   1. 1X MMR 4 L, 0.1X MMR 50 ㎖ 및 증류수에 만든 2 % 시스테인, 산도 7.7, 400 ㎖를 준비합니다. 16 ° C에서 모든 솔루션을 유지
   2. 추가 계란을 추방하기 위해, 가볍게 개구리의 허리와 복부를 짠다.
   3. , 개구리와 MMR의 대부분을 제거 각 양동이에 MMR의 약 1 ~ 200 ㎖에 계란을 떠나.
   4. 전송 피펫으로 이물질을 제거하고, 계란의 품질을 평가 : 고품질 계란은 일반적으로 어둡게 착색 된 동물 반구 가볍게 색깔의 식물 반구 사이의 명확한 분리에 의해 표시되고 가장 어두운에 빛 대비가된다. 전송 피펫으로 폐기 그들이 추출물의 품질을 전반적으로 감소하므로 (흰색과 푹신한), 힘줄 얼룩덜룩 한, 또는 용해 나타나는 계란. 계란의> 10 %의 품질이 좋지 않은 경우, 전체일괄 폐기해야합니다.
   5. 500 ㎖의 유리 비이커에 달걀을 배합 잠긴 계란을 유지하면서 가능한 한 많은 MMR을 부어.
   6. MMR의 두 배 계란 볼륨 부드러운 소용돌이에 계란을 씻어. 두 번 반복하고, 이물질이나 분명히 품질이 계란을 제거합니다.
   7. , 유리 비커에 2 % 시스테인의 약 100 mL를 넣고 섞어 부드럽게 소용돌이, 계란은 16 ℃에서 5 분 동안 정착 할 수 있도록 시스테인을 붓는다. 참고 : 그들은 지금 젤리 코트없이 작은 부피를 차지하고있는 것과 같은 Dejellying이 계란과 계란의 컴팩트 포장 위에 떠있는 젤리 코트의 점진적 모양으로 표시됩니다.
   8. , 2 % 시스테인의 또 다른 100 mL를 넣고 부드럽게 소용돌이, 5 분을 기다린 후 천천히 시스테인을 붓는다. 계란 (일반적으로 세 번째 시스테인 처리에 의한) 단단하게 압축 될 때까지 반복합니다. 참고 : 계란 시스테인에 너무 오래 남아있는 경우가 용해하는 경향이 있습니다. 마찬가지로, dejellied 계란은 깨지기 쉬운 기계 용해하는 경향이 경우 그들은그들은 공기에 노출되는 경우도 적극적으로 소용돌이 나된다. 계란이 dejellied 한 후에는 신속하게 원심 분리 단계로 진행하는 것이 중요합니다.
   9. 시스테인을 붓고, 부드럽게 1X MMR 계란을 세척하여 젤리 코트와 다른 파편을 멀리 씻어. 비커의 측면을 따라 조심스럽게 버퍼를 붓는다. 두번 반복 이상의 MMR 용액까지 흐림 더 길다. 1X MMR로 세척하는 동안은 전송 피펫을 사용하여 나쁜 계란을 제거하기 위해 계속합니다.
   10. 30 ㎖의 0.1X의 MMR과 최종 부드러운 헹굼, 부드럽게 가능한 버퍼의 정도를 부어. 다시 말하지만, 어떤 분명히 나쁜 계란을 제거합니다.
3. 원심 분리에 의해 계란 포장 및 분쇄
   참고 : 그 아래에 설명 된 추출물이 β-catenin의 분해에 사용되는은 세포 증식 억제 인자 추출물 (중기 II-체포)의 변종이다. 세포주기의 연구에 사용 된 저속 및 고속 엑기스 달리, 중간 속도 추출물은 β-카테닌 분해에 가장 적합한. 나는준비를 많이 더 많은 노동이 있지만 nterphase 추출물은 유사하게 강력한 β-catenin의 분해를 촉진한다.
   1. 10 ㎎ / ㎖의 원액에서 희석하여 20 ㎍ / ㎖ (에서와 사이토 D (DMSO에 10 ㎎ / ㎖ 원액의 희석) 10 ㎍ / ml로 류 펩틴, 펩 스타틴, Aprotinin의 혼합물 (LPA, 단백질 분해 효소 억제제를) 추가 0.1X MMR의 나머지 20 ㎖에) DMSO에.
   2. 0을 추가합니다. X MMR 세척 계란에 LPA와 사이토 D를 포함, 부드럽게 소용돌이, 16 ℃에서 5 분 동안 품어
   3. 16 ° C 미리 냉장 50 ㎖ 원심 분리기 튜브에 달걀을 전송 계란이 정착 할 수 있도록하고, 정상에서 잔류 버퍼를 제거합니다. 공기에 노출되는 것을 방지하기 전에 전송을 위해 계란을 철수로 전송 피펫으로 버퍼의 작은 금액을 인출하려면. 계란 톱 원심 관을 채울 때까지의 수율을 극대화 할 수있는 원심 분리 관에 추가로 알을 전송하고 튜브의 상부로부터 잔여 완충액을 제거하기 위해 계속압축을 풉니 다.
   4. 고정 각 회 전자를 이용하여 11 ° C에서 60 초 동안 400 XG에 계란, 스핀 원심 분리기 튜브를 포장하는. 원심 분리기 튜브의 상단에서 잔류 버퍼를 제거합니다.
   5. 분쇄 스핀의 경우, 4 ℃에서 5 분 동안 15,000 XG에서 튜브를 회전
4. 추출물의 세포질 레이어를 수집
   NOTE : 아래에 설명한 방법은 세포질 층을 수집하기 위해 원심 관의 측면을 천공의 전통적인 방법과 다르다. 이 프로토콜은 단순화를 위해 재사용 가능하다 특히 원심 분리기 튜브와 함께 사용되도록되어 있습니다. β-catenin의 분해 반응 속도에 눈에 띄는 차이는 방법도 발견되지 않습니다. 이 시점 추출물의 과정을 통해 동안 차가운 유지되어야하고, 모든 단계는 4 ℃에서 수행해야
   1. P1000 피펫 팁을 사용하여 지질 층에 구멍을 취소합니다.
   2. 어두운 색소 층과 리튬의 세포질 층 (수집깨끗한 미리 냉장 원심 분리기 튜브에 새로운 P1000 피펫 팁을 사용하여 GHT 지질 층) (그림 1). 견고 β-카테닌을 저하 고품질 추출물, 세포질 층과 인출 색소 및 지질 층의 양을 최소화한다.
   3. 스핀은 4 ° C에서 10 분 동안 15,000 XG에서 세포질 층을 추출하고 다시 세포질 층을 수집합니다. 스핀과 추출 1X를 반복합니다. 참고 : 추출물은 "밀짚 색깔"이어야합니다. 상당한 오염이 시점에서 색소와 지질 레이어가있는 경우 과도한 스핀이 β-catenin이 저하 할 추출물의 용량을 감소한다하더라도, 하나는, 스핀을 한 번 더 반복 할 수 있습니다.
   4. 10 ㎍ / ㎖를 각각의 최종 농도의 추출물에 LPA와 사이토 D를 추가합니다. NOTE : 기재된 방법을 사용하여 약 50 ㎎ / ㎖의 매우 일관된 전체 단백질 농도 (52.41 ± 5.40 ㎎ / ㎖, N = 3 별도 준비합니다) Xenopus의 소재를 산출 예G 추출물.
   5. (선택 사항) 번역 분석을 위해, 출장의 mRNA (0.1 ㎎ / ㎖)을 추가, RNAsin (1.5 U / ㎖), 에너지 재생 믹스 (2.2.1)과 2 시간 동안 실온에서 반응을 품어 (자세한 내용은 살리 지족의 등을 참조 알. ² 시브 등. ^33). β-catenin의 분해 분석 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 스냅인 동결을 즉시 번역 추출물을 사용합니다. 참고 : 갓 준비한 추출물은 외생 적으로 추가 mRNA의 번역을 할 수있는 높은 능력을 가지고 있지만, 추출물이 고정되면 불행하게도,이 용량은 손실됩니다. 덮인 mRNA를 용이하게 시판되는 키트를 사용하여 제조 될 수있다.
   6. 액체 질소의 스냅 동결 추출물. 참고 : 그들은 빠르게 다시 냉동하면 β-catenin이 저하하는 자신의 능력을 잃어 버려 추출물 단일 사용을위한 작은 (200 μL) 분량 씩 저장됩니다. 장기간 저장을 위해, 추출물은 액체 질소에 저장 될 수있다. 단기간 저장을 위해, 키스, -80 ° C에서 저장 될 수 있지만, 용량 Oβ-catenin이 저하하는 F 추출물은 극적으로 -80 ° C (2 개월 이상)에 확장 된 스토리지를 줄일 수있다.

2. β-catenin의 분해 분석을 위해 추출 준비

1. Xenopus의 추출물에서 고갈
   NOTE : Xenopus의 추출물의 주요 장점은 쉽게 경로의 구성 요소를 고갈 정확하게 그 용량 의존적 효과를 결정하기 위하여 단백질의 정량을 다시 추가 할 수있는 능력이다.
   1. 갓 준비 Xenopus의 계란 추출물을 사용하거나 신속하게 얼음에 냉동 추출물과 장소를 해동. 감기의 모든 조작을 수행합니다.
   2. 펠렛 항체 또는 친 화성 비즈 (예를 들어, 200 ml의 추출물을 20 ㎖ 펠렛 비즈)의 체적 1 / 10에 압축을 추가합니다. , 추출물의 희석을 최소화 한, 테이퍼 팁 젤 로딩 팁을 사용하여 추출물을 첨가하기 전에 가능한 한 구슬에서 많은 액체를 철회하기 위해.
   3. 회전 추출물1 시간 동안 4 ° C에서 구슬 혼합.
   4. 30 초 동안 4 ° C에서의 미세 12,600 XG에 스핀 추출물 비드 혼합. 다르게는, 자성 비드를 사용하는 경우, 비드를 수집하는 자기장을 적용한다.
   5. 전송 얼음에 신선한의 미세 튜브 추출물을 고갈. 추출물 어떤 구슬을 전송하지 않도록주의하십시오.
   6. 고갈 추출물과 구슬을 모두 면역 블에 의해 고갈의 효율성을 확인합니다.
   7. 2.2에 설명 된 β-catenin의 분해 분석을 위해 추출물을 준비합니다.
2. 제노는 β-catenin의 저하에 대한 추출 최적화
   참고 : Xenopus의 계란 추출물의 β-catenin의 분해가 빠르게 내생 ATP 매장을 소모하는 에너지에 의존하는 과정입니다. 따라서, 에너지 재생 시스템은 강력한 β-catenin의 저하를 유지하기 위해 필요합니다.
   1. 150 밀리미터 크레아틴 인산으로 구성된 20 배의 에너지 재생 (ER) 믹스를 준비, 20 mM의 ATP, 600 ㎍ / ㎖의 크레아틴 인산 활성 효소,및 20 mM의 _MgCl2를. ER은 -80 ° C에서 분주하고 저장해야합니다 작은 냉동 분취를 사용하여 반복되는 동결 / 해동 사이클을 피하십시오.
   2. 빨리 손 사이의 냉동 튜브를 문질러 Xenopus의 계란 추출물을 해동. 추출이 모두 녹아 직전에 얼음에 튜브를 놓습니다.
   3. Xenopus의 계란 추출물의 나누어지는 (200 μL)로 에너지 재생 믹스 (20 배 ER)의 10 μl를 추가합니다. 빨리 튜브와 펄스 소용돌이로 교반을 쓸어 넘겨 철저하게 섞는다. 스핀 펄스 즉시 얼음에 배치합니다.
   4. (선택 사양) β-catenin의의 매출이 약간 유비퀴틴 (1.25 ㎎ / ㎖ 최종)을 첨가하여 Xenopus의 계란 추출물을 향상시킬 수있다. 사이클로 헥시 미드는 (최종 0.1 ㎎ / ㎖) 또한 내인성 사체의 번역을 최소화하기 위해 첨가 될 수있다.
   5. 얼음에 미리 냉장의 미세 튜브에 분해 분석에 대한 적절한 볼륨을 나누어지는. 방사성 표지 된 β-catenin의 분해 분석의 경우, 2-5 ml의 각 시점에 압축을 철회. </ 리>

Xenopus의 계란 추출물 3. 방사성 표지 된 β-catenin의 분해 분석

주 : 달리 명시하지 않는 한 모든 단계는 얼음에서 수행해야합니다.

1. 방사성 표지 된 β-catenin의 준비
   1. 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 생체 합성 ^[35 S] 메티오닌 - 방사성 동위 원소 표지 단백질에 갓 준비합니다. 참고 : 생성 ³⁵ (팔십칠일는 반감기) S-표지 단백질은 쉽고 효율적으로 상업적으로 이용 가능한 생체 결합 전사 - 번역 키트를 사용하여 생산됩니다. 그것은 번역 단백질이 충분히 단백질 회전율의 변화를 쉽게 시각화 할 수 있도록 표시하는 것이 중요합니다.
   2. 성공적인 방사성 표지를 확인하려면 번역 단백질의 0.5 μL로 SDS-PAGE/autoradiography을 수행합니다. ImageJ에, ImageQuant 또는 다른 양적 PROGR 소프트웨어를 사용하여 방사능 표지 된 β-카테닌 밴드의 강도를 정량화입니다. 참고 : 방사성 동위 원소 표지 된 β-catenin의 단백질 밴드가 몇 시간 (4-6 시간) 내에서 필름에 명확하게 볼 수 있어야합니다.
   3. 저장을위한 액체 질소에 방사성 동위 원소 표지 단백질을 스냅 동결 사용할 때까지. 주 : 장기간 보관 (> 2 개월) 및 다수의 동결 / 해동 (2 이상)을 심각하게 Xenopus의 계란 추출물에 견고하게 저하하는 방사성 동위 원소 표지 된 β-catenin의 용량에 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적으로 방사성 동위 원소 표지 단백질의 안정성은 -80 ° C에서 저장 1 개월 후 유의을 거절; 따라서, 상대적으로 새로 제조 된 방사성 동위 원소 표지 된 β-catenin의이 분해 분석에서 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.
2. β-catenin의 분해 분석을 수행
   1. 체외 번역 된 β-catenin의 1-3 μL (방사성 동위 원소 표지 된 밴드 신호의 강도에 따라) 추가 (및 다른 단백질을 테스트중인 등 작은 분자) 얼음에 Xenopus의 반응 믹스 20 ㎕에. quickl하는 철저하게 혼합관과 소용돌이로 교반의 짧은 펄스를 쓸어 넘겨 Y; Xenopus의 계란 추출물은 매우 점성으로이 중요한 단계이며, 혼합되지는 결과의 일관성에 영향을 미칠 것입니다. 얼음 펄스 스핀과 장소.
   2. RT에 튜브를 이동하여 β-catenin의 분해 반응을 시작합니다.
   3. 지정된 시점에서, 시료 1 ~ 5 ㎖를 제거하고 반응을 정지 SDS 샘플 완충액 (5X 양)와 즉시 혼합한다. 확인하려면 분해 반응은 완전히 적극적으로 영화 관에게, 여러 번 소용돌이를 종료한다.
   4. SDS-PAGE/autoradiography을 수행합니다. 각 시점 / 레인의 추출물 1 ㎖ 당량 (~ 단백질 50 mg)을 실행합니다. Xenopus의 계란 추출물의 β-카테닌의 분해는 방사성 동위 원소 표지 된 β-catenin의 밴드 그림 2의 강도가 시간에 따른 감소에 의해 입증되어야한다. ImageJ에, ImageQuant 또는 기타 선호하는 이미지 소프트웨어 (필요한 경우)를 사용하여 결과를 계량화한다.
   5. (OPTIONAL)는 배경 방사능을 감소시켜 이미지의 품질을 높이기 위해 건조에 앞서 증류수) 용액 (10 % 아세트산 및 30 % 메탄올을 고정에 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔을 적신다.

Xenopus의 계란 추출 4. β-catenin이 - 루시 페라 열화 분석

달리 언급하지 않는 한 얼음의 모든 단계를 수행합니다.

1. β-catenin이 - 루시 페라 제를 준비
   1. 전체 아미노산 혼합 전사 - 번역 결합 시스템을 사용하여 비 방사성 동위 원소, 루시 페라 제 - 태그 β-catenin의 합성.
   2. 반응의 0.5 μL에서 루시 페라 제 활성을 측정하여 루시퍼 라제 - 태그 β-catenin의 생산을 확인합니다. 번역되지 않은 반응 혼합물에서 발광을 측정하여 배경 발광을 평가합니다. 참고 : 여러 상용 키트는 루시퍼 라제 활성을 측정 할 수 있습니다. 수명이 긴 발광 그러나 열화 ASSA 특히 잘 작동예.
2. β-catenin이 - 루시 페라 제의 열화 분석을 수행
   1. 해동 및 2.2으로 Xenopus의 계란 추출물을 준비합니다.
   2. 얼음에 (2.2) 준비 Xenopus의 반응 믹스에 체외 번역 된 β-catenin이 - 루시 페라 제 융합 (4.1)을 추가하고 3.2.1로 잘 섞는다. 참고 : 추출에 추가 된 β-catenin의 루시 페라 제의 활성은 일반적으로 사이 20 - 50,000 상대 발광 장치 (4.1.2에서 얻은 측정 기준) 추출물 (RLU) / ㎖. 시작 신호가 약 10 만 RLU (체외 번역 된 β-catenin이 - 루시 페라 제 융합의 2-5 ㎖)을해야한다.
   3. RT로 추출물을 이동 분해 반응을 시작합니다.
   4. 지정된 시간에 반응의 분취 량을 제거하고 스냅인 동결 액체 질소를. 참고 : 세중의 샘플은 일반적으로 각 시점에 대한 분석을 위해 제거됩니다. 냉동 추출물은 -80 ° C에 저장할 수 있습니다 UNT일리노이는 분석 할 준비가 된 것입니다.
   5. 해동 샘플 얼음, 얼음에 컬러를 96 - 웰 플레이트로 전송 샘플 및 루시 페라 제 활동에 대한 프로세스입니다.

Xenopus의 계란 추출물의 β-catenin의 저하의 회로도는 그림 2A에 표시됩니다. 35 S 표지 β-catenin의이 Xenopus의 계란 추출물에 배양, 분취 량 (1 ML 상당 추출) 적절한 시간에 제거하고 샘플을 실시 하였다 SDS-PAGE는 오토 라디오 그래피 하였다. 이 Wnt 경로의 구성 요소에 의한 β-catenin의 분해는 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (2)에 의해 매개되며, Xenopus의 추출물 [35 S] - 방사성 표지 된 β-catenin의 저하는 프로 테아 좀 억제제 MG132 그림 2B의 첨가에 의해 억제된다. 이 Wnt 경로의 구성 요소에 의한 β-catenin의 저하는 GSK3 (34)에 의해 인산화에 따라 달라집니다. 제노의 안정화 1) β-catenin의 (SA) 돌연변이 (GSK3 인산화 사이트 알라닌으로 변이) : GSK3 의존 저하가 쉽게 Xenopus의 계란 추출물을 사용하여 여러 가지 방법으로 설명 할 수있다야생 형 β-카테닌 단백질 그림 2B에 고름 계란 추출물 상대. 2) GSK3 (LiCl을)의 작은 분자 억제제는 유사하게 β-catenin의 (그림 2C)의 분해를 억제한다. 3) 마지막으로, Xenopus의 계란 추출물에서 GSK3의 고갈은 β-카테닌의 분해를 억제; 저하 외인성 GSK3의 첨가에 의해 구출 될 수 2D-E 피규어.

방사성 표지 된 β-catenin의 분해 분석은 분해의 모드 (세포 사멸 분열 대 즉 유비퀴틴 - 매개 분해)의 특히 정보를 시각적 인 평가를 제공합니다. 오토 라디오 그래피, 그러나, 노동 집약적 및, 대부분의 경우, 통로의 고 처리량 분석에 제한 (예를 들어,이 Wnt 경로의 소분자 변조기 스크리닝)이다. β-카테닌-루시퍼 라제 분해 분석은 더 쉽고 빠르게 정량화 출사 발광량 그대로 AM 정비례β-catenin이 - 루시 페라 제 단백질의 ount. 이 기능은 높은 처리량 분석에 대한 루시 페라 제 분석은 간단하고 쉽게 적응할 수 있습니다.

그것은 루시 페라 제 융합 nonfusion 단백질의 그것과 유사한 특성을 가지고 결정하는 것이 중요합니다. 이것은 경험적으로 내부적으로 N-말단, C-말단, 또는에 루시페라아제 단백질을 융합에 의해 결정될 수있다. β-catenin의의 N-또는 C-말단에 루시 페라 제의 융합은 Xenopus의 계란 추출물 2, 19, 20에서 포유 동물 세포 또는 회전율을 incultured이 Wnt 표적 유전자를 활성화하는 능력에 영향을주지 않습니다.

Xenopus의 계란 추출물 대표 β-catenin이 - 루시 페라 제의 분해 분석은 β-catenin이 - 루시 페라 제의 열화가 융합의 방사성 동위 원소 표지 된 단백질과 루시 페라 제 활동의 SDS-PAGE/autoradiography에 의해 평가 된 그림 (a)에 표시됩니다. degradatio의 비율β-catenin이 - 루시 페라 제의 n은 태그가 지정되지 않은 β-카테닌 단백질과 유사하다. β-catenin의 - 루시 페라 제 융합 저하의 규제는 β-catenin이 - 루시 페라 매출의 억제를 초래하여 LiCl의 추가 또는 GSK3의 고갈로 nonfusion 단백질과 본질적으로 동일하다. 도 3B-C에 나타낸 바와 같이, β-카테닌-루시퍼 라제 단백질의 방사성 신호의 변화는 시간에 루시 페라 제의 효소 활성의 변화를 평행. β-catenin이 - 루시 페라 제 (시험 관내 전사 - 번역 시스템에서 생성 특히 융합 단백질)를 사용하여 발생하는 문제는 내부 번역 시작 사이트 또는 조기 번역 종료 그림 3D의 사용으로 인해 발생하는 배경 루시 페라 제 신호입니다. 이 문제는 가끔 IVT 반응에 사용 된 DNA의 농도를 최적화함으로써 극복 될 수있다. 우리가 변할 때 우리는, 그러나, 배경 루시퍼 라제 활성의 감소가 관찰되지 않았다우리의 특정 β-catenin이 - 루시 페라 제의 구조에 대한 플라스미드 DNA 농도. 우리가 상기 내부 병진 개시 위치 및 / 또는 β-카테닌-루시페라아제 융합 단백질의 번역 후 조기 종료를 최소화하기 위해 돌연변이 유발을 통해 융합 단백질을 재 설계해야 할 것 같다. 루시퍼 라제 단백질 Xenopus의 계란 추출물도 3a에서 분해 반응의 시간 경과에 걸쳐 비교적 안정되어 있기 때문에 전장 β-카테닌 융합 절두 루시퍼 라제 단백질의 비율이 알려진 경우, 그러나,이 백그라운드 신호는 단순히 차감 될 수있다 .

루시 페라 제 분석의 강도는 β-catenin이 저하 변조기 높은 처리량 검사를 수행 할 수있는 멀티 웰 형식으로 확장 할 수있는 용량입니다. 그림 4에서, 대표 바둑판 분석을 억제하는 β-catenin의 분해 억제제, MG132을 사용하여 표시됩니다 프로 테아. 바둑판 실험의 결과는 분석이 96 - 웰 형식으로 균일하고 재현성 및 높은 처리량 검사에 대한 적합성을 보여줍니다 있음을 나타냅니다.

그림 1. 집중 Xenopus의 계란 추출물의 제조 방법의 개략도가. 계란이 HCG 주사 Xenopus의에서 수집되는 저속 (400 XG) 스핀으로 압축하고, 분쇄하고 중간 속도 (15,000 XG로 구분 여성을 laevis의 ) 스핀. , 등의 림프 낭에 피하 주사주의 깊게 나쁜 계란을 제거하고 텍스트에 명시된 바와 같이 신중하게 낮은 품질의 어두운 추출물에서 높은 품질의 세포질 추출물을 분리주의하십시오.

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Xenopus의 계란 추출물에 배양 할 때 IVT의 반응에 의해 제조 그림 2. β-catenin이는 Xenopus의 알 추출물.)의 분해 분석. B의 회로도를 배양 할 때 견고하게 저하) [35 S] 표지 β-catenin의이 견고하게 저하됩니다. Xenopus의 계란 추출물에 MG132 (200 μM)를 첨가 β-catenin의 분해를 억제한다. GSK3의 β-catenin의 내 phosphosites (β-catenin의 SA) 또는 LiCl을 (25 ㎜) C)의 첨가 알라닌에 돌연변이는 β-catenin의 분해. D) Axin (아미노산 506-560의 GSK3 결합 부위가) 효율적으로 고갈을 억제 GSK3는 Xenopus의 계란에서 추출한. E)는 GSK3 고갈 Xenopus의 계란 추출물은 β-catenin의 분해를 억제하고 O를 추가로 구출 될 수있다F 재조합 GSK3 (0.1 ㎎ / ㎖). 의 LiCl (25 ㎜) 블록 GSK3 고갈 추출물에서 β-catenin의 분해를 구출하는 재조합 GSK3의 용량을 첨가. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Xenopus의 계란 추출물에 배양 할 때 그림 3. 루시 페라 제 - 태그 β-catenin의이 저하됩니다.) 방사선 표지의 β-catenin의 - 루시 페라 제 태그가없는 β-카테닌 단백질과 유사한 속도로 저하됩니다. 야생형 단백질과 마찬가지로하여 LiCl (25 ㎜)의 첨가는 β-카테닌-루시퍼 열화를 억제한다. 혼자 루시 페라 제 눈에 띄게 Xenopus의 계란 추출물 넘겨하지 않습니다. β-catenin의 - 루시퍼의 루시 페라 제 활동의 변화. D 루시퍼 라 아제 활성을 측정에 의해 평가 ASE의 융합의 단백질 수준의 변화를 평행. B)의 LiCl (25 ㎜)의 추가 또는 GSK3 C의 고갈) 체외에 대한) 면역 블롯을 β-catenin이 - 루시 페라 제 회전율을 억제 번역 β-catenin의 - (안티 - 루시 페라 항체를 사용하여) 루시 페라 가능성이 방사성 동위 원소 분해 분석에 비해 높은 배경에 기여하는 특정 준비합니다 무료 루시퍼 단백질의 상당한 양을 공개했다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Xenopus의 추출물에서 β-catenin이 - 루시 페라 제의 그림 4. 규제 저하에 적용 할 수 있습니다높은 처리량 형식입니다. β-catenin의 분해 억제제 MG132 (450 μM)를 사용하여 β-catenin이 - 루시 페라 제를위한 대표 바둑판 분석. 음영 처리 된 열은 MG132 처리 우물을 표시하고 가벼운 열 (DMSO) 처리 된 우물 차량을 나타냅니다. 높은 처리량 검사의 잠재적 인 사용에 대한 허용 분석을 나타내는 0.3의 점수의 정량화 및 Z-팩터 계산 결과.

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.