인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

인두 중배엽 세포는 심장의 부분과 인두 근육 일으킨다. 배아 개발하는 동안, 두 번째 심장 분야에서 다 능성 심장 전구 세포는 인두 중배엽에서 마이그레이션 및 심장 유출 관과 우심실을 채우고, 그 이상 개발은 밀접하게 출생 결함과 출생 defect-의 선천성 심장 질환의 주요 원인과 관련된 인간 ^1-3 관련 사망. 최근의 연구는 인두 중배엽은 중배엽 심장 - 두개 안면 개발 ^4의 중요한 부분 만들기, 마음뿐만 아니라, 근육을 머리에 기여하고 있음을 증명하고있다. 따라서, 유도, 증식 및 인두 중배엽에서 머리와 심장 전구 세포의 분화를 포함하여 개발 프로세스가 활성화 조사 ^5-7 받고있다.

최근까지, 심장 전구 세포가 팽창 witho를 받아야하는지 여부 알려지지그들의 셀룰러 환경에 대한 정보의 부족으로 인해 부분적 UT 분화. 우리의 최근의 연구는 인두 아치가 심장과 근육 조상의 갱신을위한 미세 역할을하고 몇 주에 걸쳐 ⁸ 생체 전 배양 될 수 있음을 시사한다. 이 이식편 방법은 심장 - 두개 안면 전구 세포 생체의 개발을 연구하는 새롭고 독특한 기회를 제공합니다.

모든 마우스는 존스 홉킨스 대학의 동물 시설을 -accredited 실험 동물 관리의 인증을위한 미국 협회 (AAALAC) 유지 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설명 된 절차에 따라 수용했다. 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는 모든 실험 프로토콜을 승인했다.

1. 실험 준비

1. 60 분 동안 인산염 완충 용액에 10 % 태아 소 혈청 (FBS) (PBS)와 코트 12 웰 플레이트.
2. 코팅 용액을 제거하고 혈청이없는 미디어 (SFM)의 200 μl를 추가합니다. 미디어 막이 전체 표면 영역을 커버하는지 확인 접시 돌리기.

2. 외과 적 치료

1. 완전한 안락사을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 다음에 기관의 동물 관리위원회 승인 프로토콜을 사용하여 임신 쥐를 안락사.
2. 스프레이 70 %와 마우스의 배꼽 지역을 청소에탄올. 오염을 방지하기 위해 엄격한 무균 기술을 유지한다.
3. 사용 집게와 가위는 배꼽 부위에 0.5 cm ⁽²⁾ 절개를합니다.
4. / 핀치 절개 위 아래 피부를 잡아 부드럽게 반대 방향 (머리와 꼬리)에서 피부를 당겨 손가락을 사용합니다.
5. 배꼽 부위에 막에서 초기 절개를 집게와 가위를 사용합니다. 부드럽게하여 자궁을 드러내는, 각면 (2 × 1.5 cm ^2)에 난소에 배꼽에서 V 자형의 막을 잘라.
6. 따라서 난소에서 자궁을 확보, 난소 측의 난관을 끼지 난소와 가위로 자궁을 연결하는 난관이 끼지 집게를 사용합니다.
7. 부드럽게 집게로 난관에 의한 자궁을 당겨 가위로 방광 지역에서 무료로 자궁을 잘라.
8. 집게로 난관에 의해 추가로 최대 자궁를 당기고하여 M에서 자궁을 해제, 다른 측면에서 가위로 난관을 잘라여러개.
9. 50 ML 튜브에 자궁을 전송하고 ^칼슘과 마그네슘 ^2+와 살균 차가운 PBS의 20 ㎖를 추가합니다. PBS는 배아 해부하는 동안 ^칼슘과 마그네슘을 ^{2 +} 포함해야합니다.
10. 조심스럽게 피를 자궁을 씻어 10 초 동안 튜브를 흔들.
11. 집게와 튜브에서 자궁을 전송하고 10 ml의 접시에 배치하고, 자궁의 상단에 차가운 PBS 5 mL를 추가 할 수 있습니다.
12. 실체 현미경 하에서 자궁과 접시를 놓습니다.
    참고 : 2.13-2.19는 실체 현미경을 필요로 단계.
13. 조심스럽게 하나 하나 자궁에서 태아와 양수 주머니를 자궁을 열고 밖으로 해부 포셉 두 쌍을 사용합니다.
    1. 조심스럽게 배아를 둘러싸고있는 양막을 열 포셉 두 쌍을 사용하여 하나의 집게로 주머니를 꼬집어 부드럽게 배아에서 분리, 절단 및 배아에서 양막 낭을 해제하기 위해 다른 집게를 사용합니다. 특정 유전자형이 필요한 경우, 유전자형에 대한 양막 낭을 유지.
14. 측면에있는 배아를 놓고 아치와 인두 주머니 (그림 1A '') 사이에 마음에 후방 아치 ^{차 1} 차 및 2를 잘라 집게를 사용합니다.
15. 조심스럽게 다른 측면으로 배아를 뒤집어 뒤쪽 아치와 인두 주머니 사이의 심장에 1, 2 아치를 잘라 집게를 사용합니다.
16. 아직 ¹ 차 및 배아에 2 ^차 인두 아치를 연결하는 심장 유출 관을 잘라 집게를 사용합니다. 여전히 배아에서 나비 (그림 1B)의 형태로 함께 부착 된 아치를 제거합니다.
17. 핀치 집게를 사용하고 나머지 심장 유출 관 및 foregut 내배엽에서 ¹ 차 인두 아치를 해제 (그림 1B ''* 점선으로 표시하고).
18. 핀치 집게를 사용하고 나머지 심장 유출 관에서 2 ^{차 인두} 아치를 해제및 foregut의 내배엽 (그림 1B ''점선과 **로 표시).
19. 별도로 집게를 사용하여 아치의 각 쌍을 전송하고 잘 지정의 중간에 두 아치를 배치합니다. 별도의 우물에 플레이트 ¹ 차와 2 ^차의 인두 아치. 아치 단계 1.2에 추가 된 미디어의 필름과 접촉에 있는지 확인하십시오. 그것은 그들이이 기간 동안 부착을위한 우물의 표면과 접촉을해야으로 아치가 매체에 의해 포함되지 않는 것이 중요합니다.

3. 보육 및 이미지

1. 아치 웰 표면적에 첨부 2 시간 동안 37 ° C / 5 % CO _2에서 12 웰 플레이트에 도금 아치를 부화.
2. 부드럽게 잘 측면 아래로 37 ° C SFM 200 μl를 추가합니다. 아치가 부착 된 상태를 유지하는지 확인하고 / N을 O를 품어.
3. 다음 날, 시각적으로 인두 아치가 연결 부드럽게의 측면 아래로 37 ° C SFM 200 μl를 추가하고 있는지 확인잘. 아치가 부착되지 않은 부동 남아있는 경우, 부드럽게 전용 미디어의 필름이 남아 때까지 아치를 제거하지 않고 피펫 용지를 제거합니다. 잘 단계를 반복 3.1의 중앙에 아치를 배치 피펫 팁을 사용합니다.
4. 매일 모니터; 어떤 미디어를 증발 대체하기 위해 모든 2 일 미디어 ~ 100 ~ 200 μl를 추가합니다.
   참고 : 셀을 마이그레이션 한 후 24 ~ 48 시간이 아치 주위에 표시하고 증식하고 다음 5-8일을 통해 아치에서 마이그레이션합니다. 구타 심근의 36-72 시간의 형성은 2 ^{차 인두} 아치 (그림 2B)에서 관찰 할 수 후. Myotube 형성은 첨부 파일 (그림 2A) 후 ¹ 차 인두 아치 3~7일에서 관찰 할 수있다.

그들은 증식과 머리와 심장 근육, 각각 (그림 1A, '과'을 ')되고, 1 차와 2 차의 인두 아치에서 마이그레이션으로 개발하는 동안, 얼굴 근육과 심장 전구 세포는 추적 할 수 있습니다. 인두 아치를 배양하는 세부 생체 심장과 근육 발달을 연구하는 독특한 방법을 제공합니다. 해부 및 인두 아치의 부착 후, 부착 아치에서 마이그레이션 세포 배양의 24 ~ 48 시간 내에 관찰 할 수있다. 문화 myotube 형성 3 일 이내에 1 차 인두 아치와 2 차의 인두 아치에서 심근 형성 (그림 2A와 2B)에서 관찰 할 수있다. 심근 형성이 시각적으로 자발적 이주 세포 및 / 또는 특정 심근 마커 분석의 클러스터를 신축시켜 확인할 수있다 (예를 들어, 심장 트로포 닌 T). Myotu/ 얼굴 근육 형성을 육안으로 긴 자발적 연축 세포 및 / 또는 특정 근육 마커 (예 오게 닌)의 분석 (길이는 500㎛까지) 신장에 의해 관찰 될 수있다. 마우스에서 LOX-CRE 시스템을 사용하여, 중배엽 자손은 체외 배양 (도 2A '및 2b') 중에 CRE-식에 의해 형광 리포터 추적 될 수있다. 마찬가지로,이 방법으로는 관심의 특정 유전자가 조건부로 기절 또는 우리가 이전에 8 설명 된대로, 그렇지 않으면 초기 배아 치사 초래하는 과발현되는 것을 특징으로하는 자손의 운명을 연구하는 것이 가능하다.

그림 1 : 마우스 배아 (Mesp1의 CRE, Ai9) 9.5 일 포스트 수정 (E.9.5 >). () 배아의 측면을 떠났다. (PA : 인두 아치, OT : 유출 경로, LV :.. 좌심실 (A ') Mesp1의 계보 추적, RFP가 Mesp1 + 세포와 그 자손을 표시 화살표가 표시 RFP + 구약과 연속 PA2에 Mesp1-자손. ( '') 점선 심장 PA1과 PA2 후방을 잘라 위치를 표시 배아에서 절개 후 (B) 나비처럼 좌우 PA1과 PA2를 FE를 :.. Foregut 내배엽을 (나. ') RFP 표시가 자손을 Mesp1 . PA1과 PA2에 (B '') * 및 ** 어디 잘라 구약과 FE 스케일 바에서 PA1과 PA2를 해제 할 것을 나타냅니다 점선과 함께 :.. 500 μm의 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 그림.

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그림 2 :. 교양 인두 아치 (A) 교양 PA1 (문화 3 일). (A ') RFP가 PA1에 Mesp1 자손을 표시합니다. 화살표와 * 초기 myotube 형성을 나타냅니다. ( '') PA1에서 RFP 발현의 오버레이. (B) 배양 PA2 (문화의 팔일). (B ') RFP 마크 PA2에 자손을 Mesp1. 화살표와 **는 (Shenje 등. 8에서 수정) 심근의 영역을 치고 나타냅니다. (B ') PA2에 RFP 발현의 오버레이. 스케일 바 :. 250 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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