다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 3억 6천만 명의 사람들이 직업 및 개인 생활에 심각한 영향을 미치는 청력 손실로 고통받고 있습니다. 보청기는 중등도의 청력 손실에서 감각 기능을 회복할 수 있습니다. 그러나 가장 심각한 경우의 경우 가장 효과적인 치료 옵션은 인공와우(CI)라고 하는 보철 장치입니다. CI는 최대 24개의 전극으로 구성된 선형 전극 배열을 포함하며, 이 전극은 달팽이관의 스칼라 고막에 외과적으로 삽입됩니다. 전극은 나선신경절 뉴런을 직접 자극하여 청각신경1을 형성^합니다.

전 세계적으로 300,000개 이상의 장치가 이식된 CI는 매우 성공적인 의료용 임플란트이며 지금까지 보고된 가장 비용 효율적인 시술 중 하나입니다. 인공와우의 성공에도 불구하고 인공와우는 여전히 생리적 청력에 비해 주파수 분해능이 감소하는 등의 한계가 있습니다. 이로 인해 그룹이나 시끄러운 환경에서 효과적인 의사 소통이 부족하고 음악과 같은 매우 복잡한 소리를 해독하는 능력이 저하될 수 있습니다. 이러한 감소된 빈도 분해능은 CI 전극과 나선형 신경절 뉴런 사이의 갭으로 인해 큰 그룹의 뉴런이 자극되기 때문일 수 있습니다. 이 간격은 수백 마이크로미터 범위입니다 ^2,3. 이 갭을 제거하면 전극 당 더 작은 그룹의 뉴런 자극을 촉진하여 주파수 분해능과 장치의 전반적인 성능을 높일 수 있습니다 ⁴.

전극과 뉴런 사이의 갭의 영향과 다양한 최적화된 자극 프로토콜의 효과를 연구하기 위해 MEA(Multi Electrode Arrays)에서 SGN의 비침습적 전기생리학적 특성을 기반으로 한 체외 생물학적 분석을 개발했습니다 ⁵. 또한 MEA를 쉽게 수정하여 전극 모양, 크기, 재료 및 표면 거칠기를 변경하여 뉴런-전극 인터페이스를 최적화할 수 있습니다. 다음은 쥐 나선신경절 뉴런 배양으로부터 기록을 재현성 있게 획득하고 위에서 언급한 매개변수에 대한 의존성을 평가하기 위한 단계별 프로토콜입니다.

동물 관리 및 실험은 스위스 지방 자치 단체 AMT (대 Landwirtschaft 싶게 투르 데 Kantons 베른, 스위스)의 지침에 따라 수행 하였다.

1. 실험에 대한 솔루션을 준비

1. 얼음에 해동 ECM 믹스 : 세포 외 기질 (ECM) 코팅 용액을 준비합니다 (재료 표, 점 6 참조). (신경 영양 인자 또는 태아 소 혈청 (FBS) 제외) 기본 배양 배지에서 ECM 믹스 1:10 희석하고 얼음에 저장합니다.
2. (재료 표, 포인트 1 참조) 배지를 준비 : FBS 또는 뇌 유래 신경영 양인자 (BDNF)를 포함하지 않는로 Neurobasal 매체의 재고를 준비합니다. 직전에 세포 배양액에 첨가 신선한 FBS (10 %) 및 BDNF (5 NG / ㎖)으로 보충로 Neurobasal 매체.
3. (재료 표, 포인트 2 참조) 세포 외 솔루션을 준비합니다.

다자간 2. 세척 및 살균

(그림 1E)에 배치 (68) 전극이 포함되어 있습니다. 각 전극은 센터 중심에서 200 ㎛의 간격을 40 × 40 μm의 ^(2)의 크기를 갖는다. 전극은 백금으로 이루어진다. 전극은 인듐 주석 산화물로 이루어지는 회로에 의해 대응하는 접점에 연결된다. 이 회로는 SU-8 5㎛의 층에 의해 절연된다. 공급자에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오. 기타 MEA 레이아웃이 실험에 적합 할 수있다.

1. 새로운 다자간를 들어 30 초 동안 70 % 에탄올에 침지하여 그들을 헹구고 30 초 동안 증류수로 세척한다. 층류 후드에서 작업.
2. 층류 후드에서 30 분 동안 MEA 건조를 할 수 있습니다.
3. 개별 멸균 페트리 접시 (35mm X 10mm)로 각 MEA를 넣고 호일로 밀봉. 사용 전까지는 MEA를 저장할 수있다.
4. 사용한 MEA를 들어 : 효소 오디오 솔루션 1 ㎖를 함유하는 페트리 접시 (35mm X 10mm)의 MEA의 부화이온은 생체 물질을 제거 RT에서 궤도 통에 O / N (재료 표, 점 6 참조). 다음 단계 2.1에서와 같이 계속합니다.
   주 : 관리가 고무 덮인 팁 집게를 이용하여 신체의 체중 측정을 처리합니다.

문화 실험을위한 다자간 3. 준비

1. 밀봉 호일을 제거하고 전체 실험 페트리 접시 (35mm X 10mm)의 MEA를 떠난다.
2. 코트 1.1에서 조제한 용액과 MEA의 방법 : 전체 전극 면적 각 MEA에 도포 액 50 μL를 피펫 내지 (-20 ° C에 보관) 감기 200 μL 피펫 팁을 사용한다.
3. 실온에서 30 분 ~ 1 시간 동안 코트에 MEA를 할 수 있습니다.
4. 피펫을 사용하여 코팅 용액을 제거합니다. 10 % FBS 및 5ng / ml의 BDNF 보충 배양 배지 100 μl를 적용하고 조직을 도금 할 때까지 RT에 둡니다.
5. 큰 페트리 접시 (94mm X 16mm)로 코팅 된 다자간 환경을 포함하는 2 배양 접시를 놓고 1.5을 포함하는 제 작은 배양 접시를 추가가습 용 인산염 완충 생리 식염수의 ㎖ (PBS).
   주 : PBS를 함유하는 페트리 접시 작은 (단계 3.5)을 첨가하는 것은 상당히 배지의 증발을 최소화하기 위해 중요하다.

4. 나선 신경절 해부

주 : 총 박리가 층류 후드 외부에서 수행 될 수있다 (4.4-4.1 단계). 미세 절개 멸균 조건 (층류 후드)의 경우 (4.5 단계)에서 필수입니다.

1. 이전에 마취없이 잘린에 의해 동물 (5-7일 이전 마우스)를 안락사.
2. 70 % 에탄올로 분무하여 헤드 멸균.
3. 헤드 유지시킴으로써, 피부 화살 선을 따라 샤프 / 예리한 가위와 두개골 사이의 연결을 자른다.
4. sagittally 두개골을 잘라 날카로운 / 무딘 가위를 사용하여 뇌를 제거합니다.
5. 두개골에서 시간적 뼈를 잘라 살균 얼음 차가운 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS)를 포함하는 배양 접시에있는 사람들을 배치합니다.
6. dissec를 사용하여기 현미경, 미세 집게를 사용하여 고막 수포를 해부 및 내이을 격리 할 것.
7. 미세 집게를 사용하여 달팽이관의 뼈를 제거합니다.
8. (SV) 함께 집게로 나선 신경절 (SG)와 SV의 기초 부분을 잡고 천천히-정점 -to베이스에서 SV 풀기로 나선 인대 및 맥리의 vascularis를 제거
9. 코르티 (OC)의 장기 격리는 SG와 modiolus (그림 1A - C)
10. 집게와 SG와 OC의 기초 부분을 잡고 천천히베이스 - 정점에서 OC 풀기에 의해 SG와 modiolus에서 OC를 분리합니다.
11. 나선 신경절에서 잘라 횡 이식편 (직경 200 μm의 500)가 여전히 겸자 마이크로 메스를 사용 modiolus (도 1D)에 부착.

다자간 5. 나선 신경절 절편 문화

1. 이전 10 제조 한 MEA의 전극 옆에 두 개의 나선 신경절 외식 장소배지 0 μL.
2. 약 5mm 떨어진 전극 면적에서 코르티 기관을 놓습니다.
3. 조직의 손상을 피하면서 MEA 상에 외식과 코르티 기관 핀 집게를 사용합니다.
4. 37 ° C에서 인큐베이터와 문화에 조심스럽게 다자간를 놓고 5 % CO _2. 다음 날, 시각적으로 외식은 MEA에 부착했는지 검사합니다.
   참고 : 외식이 O / N을 부착하지 않은 경우, 그들은 거의 다음 일 동안 그렇게하지 않습니다. OC는이 영양 / 신경 영양 지원을 위해 문화에 인접 배치됩니다.
5. 5 일 연속 10 % FBS와 BDNF 일상 포함하는 배양 배지 100 μl를 추가합니다.
6. 6 일에 추가 십삼일 10 %를 FBS 및 5ng / ml의 BDNF와 문화 조직을 포함하는 배지 2 ㎖를 추가합니다.

6. 전기 생리 녹음은 자발적인 및 전극 자극 종속 활동을 조사하기

1. 세포와 MEA 문화를 씻으 그래서lution 실온에서, 단계 1.3에서 준비했다.
2. 조직과 연락처를 건조하고 MEA 설정에 MEA를 탑재합니다.
   주 : 장착하는 동안 습기 문화를 유지하는 문화에 세포 외 용액의 작은 방울을 추가합니다.
3. 세포 외 용액 300 μl를 추가하고 시스템이 안정 될 수 있도록, 녹음하기 전에 10 분 동안 기다립니다.
4. 기록에 눌러 모든 전극에서 2 분 녹음 자발적인 활동 / 소프트웨어의 버튼을 획득하고 기록 전극을 식별합니다.
5. MEA 전극 자극 : 해당 소프트웨어에 대한 자극의 진폭 / 시간 / 형태를 선택하고 연속으로 ¹³ 설명 여러 전극에 적용됩니다. (단계 6.4에서와 같이) 운동량을 나타내는 것들에 기초하여 상기 전극을 선택한다. 나머지 모든 전극에서 기록.
6. 자극 이슈를 제외하려면, 동일한 전극에서 10 배를 자극한다. 문화 10 배 중 적어도 8 응답하는 경우, 그것은으로 가정 할 수있다전극에 의한 자극에 따라 긍정적 인 반응.
7. 배경 잡음을 확인하기 위해, 1 μM의 cultureat에 농도 복어 (TTX)를 적용한 2 분간 전압 게이트 된 나트륨 채널을 차단하는 레코드. 스파이크 검출 (7.1 및 7.2)을 수행하는 데 사용합니다.

7. 데이터 분석

주 : 데이터 분석 이전 ⁶ 및도 ^5에 상세하게 설명 하였다. 본 연구에 사용 된 소프트웨어에 대한 구체적인 내용은 재료 표, 점 (7)을 참조하십시오.

1. 적절한 소프트웨어를 사용하여 표준 편차 및 후속 판별에 기초하여, 검출기를 사용한 각 전극에 대한 운동량을 검출한다. 이 ^{절차는도 6에서} 설명한다. 활동 빠른 과도 전압 (<5 밀리 초)를 나타납니다.
2. 거짓 positiv 구별 각 실험 samples.Adapt을 임계 값 처리 한 TTX 분석시 전혀 활성을 초래 임계치를 선택전자 및 위음성 탐지.
3. 사용하기 적합한 소프트웨어는 표준 절차 (- C도 2a 참조)에 따른 래스터 플롯 각 검출 전극의 신경 활성을 관찰한다.
4. 결정하고 1 밀리 초 단계로 이동 10 밀리의 슬라이딩 윈도우 내의 모든 감지 이벤트를 합산하여 전체 네트워크 활동을 표시합니다.
5. 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 원 데이터를 표시하여 자극 유도 활성을 검출한다. 오프라인 수동으로 하나의 스파이크를 식별합니다. 단일 스파이크 자극 이슈 (그림 2E의 화살표 머리) 이후에 발생, 빠른 과도 전압 나타납니다. 예는도 2e에 도시되어있다.
6. 실험에 따라 대응 전극의 개수의 응답을 달성하기 위해 필요한 임계 전극 관심 ^5의 다른 파라미터에 따라 활동 전위의 수를 분석한다.

8. 조직 고정 및 IMMunohistochemistry

주 : 염색 프로세스가 MEA를 파괴 할 것이다. 시약 재료 표 (점 4)를 참조하십시오.

1. 직접 녹음 한 후 37 ° C 따뜻한 PBS로 3 회 문화를 씻는다. PBS를 폐기하고 10 분 동안 37 ° C로 예열 (PBS)에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 적용합니다.
   주의 : PFA는 독성이다. 가이드 라인에 따라 적절한 보호 및 폐기 용액과 화학 후드에서 작업 할 수 있습니다.
2. PBS와 문화를 세 번 세척하고 2 시간 동안 PBS의 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) (0.01 % 트리톤-X100)를 차단합니다.
3. 최초의 항체를 PBS (2 % BSA와 0.01 % 트리톤-X100)에 희석 (안티 βIII 튜 불린, TUJ 항체)를 추가하고 4 ℃에서 O / N 두십시오. PBS와 문화를 세 번 씻으십시오.
   참고 : 지금의 보조 형광 표지 항체의 표백을 최소화하기 위해 가능한 한 자주 어둠 속에서 샘플을 유지에서.
4. PBS에 희석 이차 항체를 추가 (2 % BSA의D 0.01 % 트리톤-X100)와 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 배양한다. 핵이 1을 추가 얼룩 : 10,000 DAPI (1 ㎎ / ㎖ 주식을) 10 분 동안.
5. PBS로 3 회 세척하고 얇은 커버 전표에 뒤로 샘플을 탑재 (24 × 50 ㎜ × ²⁾ 장착 매체 (재료 표, 점 4 참조)를 사용하여. 5 배와 20 배 배율 형광 현미경을 사용하여 이미지.

그림 1은 MEA에 조직을 분리, 준비 및 문화에 대한 절차를 요약 한 것입니다. 우리는 코르티 (OC) 및 맥리의 vascularis (SV)의 기관의 감각 상피에서 나선 신경절 (SG)를 분리하는 조직 절개의 연속적인 단계를 표시하고 나선 인대를 첨부 (그림 1 A - C). 개략적으로 그림 1D에 예시 된 전극의 면적 (2.2 mm 2)를 통해, MEA (그림 1E)에 배치로 나선 신경절 외식 (번호 3-4) 신경절에서 마이크로 가위로 잘라된다. OC는이 전극 표면의 외부에 근접하여 배치된다. 배양의 성장 시간 (도 1G)를 통해 모니터링 할 수있다. 프로토콜의 개략도는도 1F에 도시되어있다. 전기 생리 활성을 장기간 배양 시간 증가 배양 6 일 후 검출 될 수있다. 우리는 r에ecommend 이전 시점 (5)에 비해 기록 전극의 상당히 높은 숫자를 생성 십팔일 문화를 평가.

그림 1. 세포 배양 준비. (A)는 갓 마우스 내부 귀를 해부. 화이트 라인은 달팽이관의 위치, 검은 점선은 전정 영역을 나타냅니다 나타내는 파선. 달팽이관 뼈 벽의 제거 후 (B) 마우스 내이. 인공 와우 회전 흰색 점선으로 표시됩니다. (C) 나선 신경절 (SG)와 modiolus는 코르티 (OC)와 맥리의 vascularis (SV) 및 나선형 인대의 기관 절개 후 표시됩니다. (D) SG와 OC의 해부 및 SG 이식편 준비 {게시자로부터 승인을 5에서 적응도}의 도식. 본 연구에 사용 된 여러 전극 배열 (E) 그림. 레코딩전극들은 중앙에 사각형 격자 구성 및 2.2 mm (2)의 면적을 차지한다. 4 접지 전극과면 접촉이 도시되어있다. 문화 프로토콜 (F) 도식. 녹음은 하루 18 (G) 대표 사진 (명 시야 이미지)과 하루 1, 6, 18 스케일 바 = 400 μm의에서 문화 모니터링 MEA에 SG 외식의 방식으로 수행된다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

자발적인 활동은 MEA에 감지 플롯의 각 라인이 검출 된 스파이크를 나타내는 래스터 그래프로 표시 할 수 있습니다. (그래프에서 서로 다른 색) 여러 전극으로부터 검출 된 자발적인 활동을 보여주는 대표적인 예는 (그림 2A, 2B, 및 2C)에 표시됩니다.

(도 2d)의 자극에 사용되는 펄스 이상성을 나타내는 대표적인 예 5 대응 전극 (적색 트레이스) 및 비 응답 전극 (블루 트레이스)은도 2e에 도시되어있다. 이들 실험에 대해 하나의 전극은 자극 및 기록에 대한 모든 다른 전극을 사용 하였다. 단일 활동 전위는 자극 이슈 (검은 색 화살표 머리) 후 1 밀리 초 등장. MEA는 전극 영역에 신경 프로세스의 적용을 평가하기 위해 절차의 끝에서 면역 염색 할 수있다. 도 2F에서 녹색으로 표시 전극은 자극을 사용하고, 적색의 표시 전극은 응답 (도 2e)를 기록하는데 사용되었다.

MEA 그림 2. 데이터 기록. (A </ strong>을) 자발적 활동을 보여주는 여섯 63 중 전극의 원래 기록의 흔적. 스파이크 검출 후도 2a의 여섯 전극 (B) 래스터 플롯. 각 막대는 하나의 활동 전위를 나타냅니다. 모든 전극 활동 (A와 B)를 포함 (C) 래스터 플롯은 2 분 63 전극 (채널 번호 0-63)에서 기록된다. (D) 총 80 마이크로 초 지속 시간 80 μA의 진폭을 가진 이상성 자극은 하나의 전극 (그림 2 층에서 E58)에서 문화의 자극에 사용되었다. (E) 또는 자극 후 응답 (파란색 흔적)없이 전극 활동 전위 (빨간색 흔적)를 보여주는 58에서 자극 후의 원시 데이터 트레이스의 대표적인 예 (검은 색 화살표 머리). 신경을 시각화하는 실험의 끝에 (F) 신경 마커 TUJ (녹색)에 대한 면역 염색 MEA 나선형 신경절 문화 전극 면적의 최종 범위는 {그림은 게시자의 승인을 5에서 적응}. 자극에 사용되는 전극 (58)이 녹색으로 표시됩니다, 응답 전극은 빨간색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마지막으로, MEA 설정이 기록 감도를 증가시킬 수 전극 표면 개질을 연구 수 있습니다. 150 nm 두께의 백금 층 (임피던스 : 400 KΩ / 1 KHZ)로 구성된 그레이 백금 (그레이 PT) : 두 개의 시판 MEA 전극이 서로 다른 백금 표면이 본 연구에 사용 된 블랙 백금 (블랙, PT), 마이크로 제조 공정 (20 KΩ / 1 kHz에서의 임피던스)의 단부에 백금의 전기 화학적 증착에 의해 얻어진. 자세한 내용은 재료 표 (지점 6)를 참조하십시오.

블랙 백금 전극 대 회색 3. 비교 그림. 두 전극 타입 (회색과 검은 색 편) 12 독립적 인 MEA의 문화, 각각의 MEA 유형에 6을 사용 나란히 비교 하였다합니다. (A) 재의 총계실험 당 sponding 전극이 표시됩니다. 6 독립적 MEA 실험에서 30-35 독립 전극 쌍을 이용하여 측정 한 (B)의 응답을 유도하는 진폭 임계 값을 도시한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. (학생 t 테스트 P <0.001) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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