Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

요약

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

초록

항 원 특정 살인에 대 한 현재 방법은 생체 외에서 사용을 제한 또는 전염병 모델에 활용. 그러나, 감염 없이 항 원 특정 살인을 측정 하기 위한 프로토콜이 아니라 있다. 이 프로토콜은 설계 및 항 원 특정의 검출 함으로써 이러한 한계를 극복 하는 방법을 설명 합니다⁺ T vivo에서세포 CD8 하 여 목표 셀의 살인. 이 분석 결과 죽이고 전통적인 CFSE 표시 대상 접종 모델을 병합 하 여 수행 됩니다. 이 조합은 분석 결과 감염 또는 종양의 성장에 따라 의존 하지 않습니다 직접 그리고 신속 하 게 항 원 특정 CTL 잠재력을 평가 하는 연구원을 수 있습니다. 또한, 판독 cytometry에 기반 하 고 그래서 대부분 연구자에 게 쉽게 접근할 수 있어야. 연구의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 테스트 중인 가설에 적합 한 식별 됩니다. 항 원 강도 변화와 차동 cytolytic 함수에서 발생할 수 있는 T 세포에 돌연변이 세포 수확 및 평가 대 한 최적의 시간을 결정을 신중 하 게 평가 해야 합니다. 예방 접종에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 맞게 최적화 된 hgp100_25-33 , OVA_257-264, 하지만 추가 유효성 검사는 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 펩 티 드에 대 한 필요할. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

서론

CD8의 cytolytic (CTL) 잠재력을 평가 하기 위해 존재 하는 여러 프로토콜⁺ 또는 CD4⁺ T-셀. 이 평가 생체 외에서 제어 조건^1,,23에서 쉽게 할 수 있습니다. 또한, 전염병 모델, LCMV, 고전적인 차동 CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르) 대상 셀을 표시를 사용 하 여 CTL 기능 검사 어디는 CFSE^안녕-레이블이 지정 된 셀 펩 티 드 및 CFSE^lo펄스-레이블이 대상 셀 남아 있다 unpulsed. 셀에 1:1 비율로 주입은 그리고는 CFSE^안녕의 손실에 대 한 평가-흐름 cytometry⁴펄스 대상 이라고 표시 된. 백신 및 제거 모델도 비슷한 전략에 vivo에서 두 CD8 살해의 평가 대 한 사용⁺ 와 CD4⁺ T 세포 뿐만 아니라 NK 세포^5,<....

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 텍사스 대학 MD 앤더슨 암 센터의에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 백신에 대 한 펩 티 드의 준비

1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 적절 한 농도와 30에 대 한 소용돌이와 동결 건조 된 펩 티 드를 분해 s.
   참고: hgp100_25-33, 최종 농도 1 mg/mL 및 OVA_257-264, 최종 농도 0.5 mg/mL입니다. 주입 전에 펩타이드 reconstitute 재구성 후 저장 하지 마십시오.

2입니다. 유전자 변형 마우스에서 Splenocytes의 격리

참고: 셀 별개로 비장의 살 균 방식으로 수행 되어야 합니다.

1. 승인 된 CO₂ 질 메서드를 사용 하 여 OT-1 유전자 변형 마우스를 안락사 하 고 비장을 제거 합니다.
   참고: 적절 한 유전자 변형 마우스는 선택의 펩 티 드에 대 한 특정이 단계에서 이용 된다.
   1. 그것의....

결과

CFSE 표시 대상 셀의 주입, 전에 1:1 셀 혼합 CFSE^안녕 와 CFSE^소호 대상 셀의 기준 주파수를 결정 하는 흐름 cytometer에서 실행 됩니다. 그림 1 A CFSE 인구에 있는 변화를 검출 하는 제어 전략, 초기 게이트 FSC 그리고 SSC 매개 변수를 사용 하 여 이루어집니다. 이 인구는 레이블 없는 생 splenocytes에 비해 상대적으로 작은 총 CFSE 긍정적인 세포는 주파수에 있는 변화를 평가 하기 전에 subgated 다음. CFSE^{안녕하세요} 고 CFSE^lo 인구의 상대 주파수 100% 총 CFSE 양성 인구를 설정 하 여 계산 이다. 이 분석을 할 수 있는 히스토그램 또는 점 작의 형식을 사용 하 여. 주입 전에 CFSE 인구의 상대 주파수의 예를 들어

토론

이 프로토콜은 간단 하 고, 신중 하 게 수행 해야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 다음 테스트 되 고 항 원 특정 T 세포의 주입 covax 못쓰게 펄스 목표의 모든 살인을 볼 필요가 있다. 물 기반 covax 예방 접종 급성 염증 상태, 만성 염증 성 단계에 대 한 만듭니다 수 있지만 더 나은 생산할 수 있습니다 느린 원 출시 석유 기반의 접근 방식으로 단기 물에 기초를 둔 배합을 대체 결과^7,12.

또한, antigen pulsing 해야 이상적인 흐름 cytometry 판독에 대 한 균일 한 다음 대상 셀의 CFSE 라벨. CFSE^안녕 5 µ M와와는 CFSE^lo 0.5 µ M와 라벨이 제공 하는이 시스템 로그 차이 쉽게 구별 될 수 있는 인구에에서 적합 하 발견 되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6주에서 12주 된 암컷 C57BL/6 마우스	찰스 리버	027	C57 블랙 6 마우스
OT-1 6-12 주 된 여성 마우스	잭슨 랩스	003831
hgp10025– 33	CPCScientific	834139	KVPRNQDWL
OVA 257– 264	CPCScientific	MISC-012	SIINFEKL
이미퀴모드 크림 5%	Fougera	51672-4145-6	Aldara Cream
CD40 특정 mAb	BioXcell	BE0016-2	클론 FGK4.5
rhIL-2 단백질	Hoffman LaRoche Inc	136	재조합 인간 IL-2 단백질
70% 이소프로필 알코올 준비	Kendall	S-17474
PBS	Life Technologies	10010-023	인산염 완충 식염수
FBS	Life Technologies	26140-079	태아 소 혈청
RBC 용해 완충액	Life Technologies	A10492-01	적혈구 용해 완충액
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
L-글루타민	Life Technologies	25030081
Pen/Strep	Life Technologies	15140122	페니실린/스트렙토마이신
CFSE	Life Technologies	C34554	5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate 숙시니미딜 에스테르
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma	A4503
1.5 mL MCT 졸업 자연	Fisher	05-408-129	마이크로 원심분리기 튜브
70% 에탄올	Fisher	BP8201500	EtOH
Trypan 블루 용액, 0.4%	Life Technologies	15250-061
혈구계	Fisher	267110
27 게이지 바늘	BD	305109
1 mL 주사기	BD	309659